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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-29166
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2916/


Molekulare Charakterisierung der Glutathion S-Transferasen OvGST1, OvGST2 und OvGST3 aus Onchocerca volvulus (Leuckart, 1893)

Molecular characterization of the glutathione S-transferases OvGST1, OvGST2 and OvGST3 from Onchocerca volvulus (Leuckart, 1893)

Höppner, Jana

Originalveröffentlichung: (2006) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60 (Pt 8) : 1496-1497; J Biol Chem. 2005; 280 (13) :12630-12636
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SWD-Schlagwörter: Glutathiontransferasen , Onchocerca volvulus , Spleißen , Lokalisation , Immunohistologie , Kristallstruktur , Enzyme-linked immunosorbent assay
Freie Schlagwörter (Deutsch): Omege GST , Antikörperaufreinigung , cis-trans-Spleißen
Basisklassifikation: 44.45 , 42.13 , 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Liebau, Eva (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 06.06.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Weltweit sind über 18 Millionen Menschen mit dem Erreger der Flussblindheit Onchocerca volvulus infiziert. Die Krankheit durch Vektorkontrolle und Massenbehandlung mit dem mikrofilariziden Medikament Ivermectin zu eliminieren, waren bis jetzt erfolglos. Daher ist die Erforschung neuer Angriffspunkte für die Entwicklung effektiver makrofilarizider Medikamente dringend erforderlich.
Das Überleben von O. volvulus im Menschen wird durch Abwehrstrategien des Parasiten ermöglicht, in deren Zentrum die Glutathion S-Transferasen (GSTs) stehen. Diese für den Parasiten essentielle Enzymfamilie detoxifiziert endogene und xenobiotische Substanzen, so auch Chemotherapeutika. Ein gegen GSTs wirkendes Medikament würde das Überleben im Wirt erschweren oder gar unmöglich machen. Aufgrund geringer Kenntnisse über Strukturen und Funktionen der GSTs von O. volvulus war deren Charakterisierung Ziel dieser Arbeit.
In O. volvulus sind bis lang drei GSTs bekannt: die OvGST1 mit ihren Isoformen a und b, die OvGST2 und die OvGST3. Um spezifische Inhibitoren gegen die OvGST1 und OvGST2 zu entwickeln, wurden Proteinkristalle beider Enzyme angefertigt und deren Struktur bestimmt.
Die OvGST1 und OvGSt2 wurden rekombinant in E. coli exprimiert, aufgereinigt und die enzymatisch aktiven Proteine für Kristallisationsversuche eingesetzt. Nach einer Optimierungsphase wurden mit der hängenden Tropfen-Methode Kristalle erzeugt. (Kristallisationsbedingungen der OvGST1: 16 °C, 3 µl 8,3 mg/ml Proteinlösung, 3 µl Kristallisationslösung bestehend aus 0,1 M HEPES Na pH 7,5, 10 % v/v Isopropanol, 20 – 24 % w/v PEG 4000; OvGST2: 16 °C, 2 µl 6 mg/ml Proteinlösung, 2 µl Kristallisationslösung bestehend aus 0,1 M HEPES pH 7,5, 10 % v/v Isopropanol, 24-25 % w/v PEG 3350). OvGST1-Kristalle entstanden innerhalb einer Woche. Die bis tato unvollständige Struktur ließ auf eine breite und offene Substratbindungstasche feststellen, die in Übereinstimmung mit der gefundenen Prostaglandin D2 Isomeraseaktivität steht.
Bei der zytosolischen OvGST2 entstanden innerhalb von 2-3 Tagen Kristalle. Die Struktur der OvGST2 wurde sowohl mit dem natürlichen Substrat GSH, als auch mit dem kompetetiven Inhibitor S-Hexylglutathion ermittelt (in Kooperation mit Dr. Perbandt, Universität Hamburg/DESY). Die Strukturanalyse ergab, dass ein Aminosäure-Austausch im aktiven Zentrum zu signifikanten Strukturänderungen zwischen der humanen Pi-Klassen GST (Arg13) und der OvGST2 (Leu13) des Parasiten führten. Es konnte eine wesentlich breitere Substratbindungsstelle der OvGST2 festgestellt werden, die zu einer anderen Substratspezifität führt und damit eine Basis für Inhibitorentwicklung bietet.
Der OvGST3 wird eine Schutzfunktion vor reaktiven Sauerstoffspezies zugesprochen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen der OvGST3 auf cDNA-Ebene konnten die Expression dreier alternativer Spleißprodukte bestätigen. Desweiteren konnten fünf Initiationspunkte für Trans-Spleißprozesse ermittelt werden. Dies führt durch trans- und alternatives Spleißen zu einem Nachweis von 14 verschiedenen Transkripten der OvGST3, wobei das potenzielle Signalpeptid mit in diese Spleißprozesse involviert war. Dieser Befund bestärkt die Vermutung, dass die OvGST3 eine sehr breite Substratspezifität zeigt und unter Umständen unterschiedliche Funktionen ausübt.
Die rekombinante Expression der verschiedenen Spleißvarianten der OvGST3 in E. coli gelang erst nach Verwendung eines Maltose-bindenden Fusionsproteins in löslicher Form. Nach Abtrennung des Fusionsproteins kam es zum Ausfallen der OvGST3, das durch Zugabe von Reduktionsmitteln geringfügig verhindert werden konnte. Eine Enzymaktivität konnte jedoch bisher nicht nachgewiesen werden.
Eine Transkriptvariante mit einem hoch immunogenen Sequenzbereich wurde für die Antikörperproduktion eingesetzt. Mit Hilfe des gebildeten Antikörpers konnte die OvGST3 in Schnitten von O. volvulus lokalisiert werden. Sie fand sich fast ausschließlich in der Eihülle. Andere Onchocerca-Arten und andere Filarien reagierten teilweise mit dem OvGST3-spezifischen Antikörper.
Für die Identifizierung potenzieller Vakzinekanditaten ist eine genaue Immunantwort von Patienten von großer Bedeutung. Daher wurde die IgG1- und IgG4-Immunantwort generalisierter (n= 40) und hyperreaktiver (n= 77) Onchozerka-Patienten auf die rOvGST3 untersucht. Über 90 % der Patientenseren erkannten die OvGST3 als Antigen. Im Vergleich zu den Kontrollseren konnte ein signifikanter Anstieg von IgG4 beobachtet werden. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied der Immunglobulin-Reaktionen zwischen IgG1- und IgG4-Antworten festgestellt werden. Eine Abhängigkeit der Immunantworten von der Mikrofilariendichte (<10 Mf/mg Haut bzw. >96 Mf/mg Haut) war jedoch signifikant.

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