Funktionelle Analyse des Regulatorproteins ICP0 von Herpes Simplex Virus Typ 2

Abstract

ZUSAMMENFASSUNG

Die humanpathogenen Herpes Simplex Viren verursachen neben den charakteristischen Hautläsionen auch schwerwiegende Krankheitsbilder wie Enzephalitiden und Meningitiden mit zum Teil tödlichem Verlauf. Auf Grund dieser klinischen Relevanz ist die Aufklärung des herpesviralen Replikationszyklus schon lange Gegenstand der medizinischen Forschung. ICP0 ist ein multifunktionelles Regulatorprotein der Herpes Simplex Viren. Es ist essenziell für die Reaktivierung der Herpesvirusgenome aus der Latenz und spielt eine entscheidende Rolle in der viralen Genexpression. Des Weiteren ist für ICP0 eine Funktion als RING-E3-Ligase im Ubiquitin-Proteasomen-System beschrieben worden. Hierdurch ist ICP0 in der Lage, im Verlauf der Infektion diverse zelluläre Proteine zu degradieren. Zwei dieser Proteine, PML und Sp100, sind Hauptbestandteile der so genannten PML-Kerndomänen. Ihr ICP0-vermittelter Abbau könnte in Bezug auf die Virusreplikation von Vorteil sein. Trotz intensiver Untersuchungen konnte jedoch bisher keine direkte Interaktion zwischen ICP0 und PML/Sp100 nachgewiesen werden. Außerdem konnte keine direkte Ubiquitinylierung der beiden Proteine durch ICP0, welche letztendlich zum Proteasomen-vermittelten Abbau führt, beobachtet werden. Daher lag der Schluss nahe, dass weitere, bisher unidentifizierte Faktoren an der ICP0-vermittelten Degradation von PML und Sp100 beteiligt sein müssen. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung möglicher Faktoren, welche in der Lage sind, die E3-Ligasefunktion von ICP0 zu beeinflussen. Auf Grund ihrer in der Literatur beschriebenen Eigenschaften kamen die beiden zellulären Proteine HIPK-2 und Siah-1 als Kandidaten für eine Funktion im ICP0-vermittelten Abbau von PML-Kerndomänenbestandteilen in Frage. HIPK-2 lokalisiert ebenso wie PML in PML-Kerndomänen und wird auch posttranslational SUMO-1 modifiziert. In den durchgeführten Experimenten konnte jedoch keine Wechselwirkung zwischen HIPK-2 und ICP0 festgestellt werden. Siah-1 wurde als direkte E3-Ligase für PML beschrieben. In den hier durchgeführten Untersuchungen konnte mit der E3-Ligase Siah-1 in der Tat ein neuer zellulärer Interaktionspartner von ICP0 identifiziert werden. Durch Verwendung von ICP0- und Siah-1-Deletionsmutanten konnten die für die Komplexbildung entscheidenden Domänen, in ICP0 der Aminosäurebereich 182-490 und in Siah-1 der Aminosäurebereich 141-282, eingegrenzt werden.

Als Folge der Wechselwirkung von ICP0 mit Siah-1 konnte einerseits ICP0 als erstes virales Substrat der zellulären E3-Ligase Siah-1 beschrieben werden, was zu einem proteasomalen Abbau von ICP0 nach Überexpression von Siah-1 führte. Es konnte gezeigt werden, dass Siah-1 durch den Abbau von ICP0 in der Lage war, die E3-Ligasefunktion von ICP0 zu inhibieren. Andererseits resultierte diese Wechselwirkung in einer Stabilisierung von Siah-1 in Anwesenheit von ICP0. Diese Stabilisierung erfolgte auf Proteinebene und konnte auf die Interaktion der beiden Proteine zurückgeführt werden. In weiterführenden Experimenten wurde gezeigt, dass Siah-1, vermutlich durch seine E3-Ligaseaktivität und die Stabilisierung durch ICP0, eine essenzielle Rolle im ICP0-vermittelten PML-Abbau spielt. Nach Hemmung der Siah-1-Genexpression mittels RNA-Interferenz (RNAi) war ICP0 nicht mehr in der Lage, zelluläres PML zu degradieren. Durch die Identifizierung einer neuen Wechselwirkung zwischen viralem ICP0 und zellulärem Siah-1 leistet diese Dissertation einen weiteren Beitrag zur Aufklärung der vielfachen Virus-Wirtswechselwirkungen von Herpes Simplex Viren. Zusätzlich konnte mit Siah-1 ein essenzielles Bindeglied im ICP0-vermittelten Abbau von PML beschrieben werden, dessen Funktion im Verlauf der viralen Replikation trotz zahlreicher Untersuchungen noch weitgehend ungeklärt ist. Die hier vorgestellten Ergebnisse bilden deshalb die Grundlage zur zukünftigen Aufklärung der PML-Funktion im Kontext der Herpes Simplex Virus Replikation.