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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-29838
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2983/


Etablierung eines GFP-basierten Reportergensystems in Staphylokokken

Development of a GFP-based reporter gene systeme in staphylococci

Franke, Gefion

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SWD-Schlagwörter: Staphylococcus , Grün fluoreszierendes Protein
Freie Schlagwörter (Deutsch): icaADBC AAP Biofilmbildung
Basisklassifikation: 44.43
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Sobottka, Ingo (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 17.07.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Ausgehend von seiner Fähigkeit zur Biofilmbildung stellt Staphylococcus epidermidis im Rahmen von fremdkörperassoziierten Infektionen den am häufigsten isolierten Erreger dar.
Die S. epidermidis Biofilmbildung verläuft typischerweise in zwei Phasen. Nach der primären Bindung der Bakterien an die zu besiedelnde Oberfläche kommt es zur Akkumulation in einem mehrlagigen Biofilm, an dessen Entstehung sowohl Polysaccharide als auch Proteine beteiligt sind. Die Expression der beteiligten Faktoren unterliegt dabei einer komplexen Regulation.
Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Etablierung eines green fluorescent protein (GFP) basierten Reportergensystems in S. epidermidis, das in situ Untersuchungen differentieller Genexpresssionsmuster innerhalb eines lebenden Biofilms und im Verlauf seiner Entstehung ermöglicht.
Exprimiert man GFPmut3.1 unter der Kontrolle eines xyloseinduzierbaren Promotors im Plasmid pAS1 in S. epidermidis 1457, so lässt sich unter induzierten Bedingungen kein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität messen. Diese Beobachtung ist möglicherweise auf die in gram-positiven, G+C armen Bakterien häufig herabgesetzte Translationseffizienz heterologer Gene zurückzuführen. Deshalb wurde zunächst durch Insertion verschiedener staphylokokkeneigener Shine-Dalgarno-Sequenzen vor dem gfp Startcodon der Einfluß dieser Region auf die Expression in S. epidermidis 1457 mittels quantitativer und qualitativer Fluoreszenzanalyse untersucht. Die Voranstellung der SD-Sequenz des Haemolysin delta Gens (hld) führte zu einem starken Anstieg der Fluoreszenzintensität nach Induktion, während unter Verwendung der SD-Sequenz der Superoxiddismutase (sod), des staphylokokkeneigenen akzessorischen Regulators (sarA) oder einer Konsensus SD-Sequenz für gram-positive Organismen kein ausreichendes Fluoreszenzsignal messbar war. Zusätzlich wurde die Auswirkung dieser SD-Sequenzen auf die gfpmut3.1 Transkription und Translation untersucht. Es fand sich bei allen Konstrukten eine identische Transkriptionseffizienz. Gleichzeitig ließen sich auf Translationsebene deutliche Unterschiede im GFP-Gehalt der Proben ermitteln, die in Analogie zu den Ergebnissen der quantitativen Fluoreszenzanalyse standen. Infolgedessen ist die Fluoreszenzintensität des GFPmut3.1 in S. epidermidis also vor allem von der maßgeblich durch die SD-Sequenz beeinflussten Translationseffizienz abhängig.
Unter Verwendung der hld SD-Sequenz wurden die biologischen Eigenschaften des GFPmut3.1 in S. epidermidis 1457 charakterisiert. Vier Stunden nach Induktion ließ sich erstmals ein Fluoreszenzsignal detektieren, die Halbwertszeit betrug sieben Stunden, wobei Westernblot Untersuchungen zeigen, dass die Abnahme der Fluoreszenzintensität hauptsächlich auf dem Abbau des Proteins beruht. Untersuchungen des Biofilmphänotyps von S. epidermidis 1457 zeigen, dass die Anwesenheit des Reporters keinen Einfluß auf die Fähigkeit zur Biofilmbildung diese Stamms nimmt, und dass es innerhalb eines Biofilms zu einer homogenen GFP-Expression kommt. Somit stellt GFPmut3.1 unter Verwendung einer optimierten SD-Sequenz ein geeignetes Reportergensystem zur Untersuchung differentieller Genexpression in S. epidermidis dar.
Kurzfassung auf Englisch: Development of a Green Fluorescent Protein based reporter gene system in Staphylococcus epidermidis

Based on its biofilm forming capacity Staphylococcus epidermidis is the most frequent cause of foreign-body related infections. Several specific factors mediating primary attachment and accumulation have been characterized. In order to analyze the concerted action of these factors methods for in situ expression analysis are demanded. The aim of the present study was to establish a Green Fluorescent Protein (GFP) based reporter gene system in Staphylococcus epidermidis. Therefore we cloned gfpmut3.1 (Clontech) into pASI under the control of a xylose-inducible promotor and introduced the resulting construct into S. epidermidis 1457. However, under xylose induction no significant increase of fluorescence intensity compared to the un-induced control was detected. This finding may be attributed to inefficient translation initiation at the natural Shine-Delgarno (SD) sequence. Indeed, by coupling different SD-sequences from well-characterized S. epidermidis genes in front of the gfp start codon the crucial impact of this element for gfp translation initiation was demonstrated: whereas a strong fluorescence signal was obtained in presence of the hld SD sequence, almost no signal was detected with the sarA SD sequence. The influence of different SD sequences on transcription and translation of gfpmut3.1 was also analyzed in real-time transcription and semi-quantitative western blotting experiments. In all constructs investigated an almost identical gfp transcription level was found regardless of the SD sequence present. In contrast, western blot analysis using an anti-GFP antibody revealed huge differences in GFP amounts that corresponded to the respective quantitative fluorescence signal. The calculated half-.life in S. epidermidis 1457 is 7 h.
Importantly expression of GFPmut3.1 did not interfere with biofilm-positive phenotype in this stain In conclusion, using an appropriate SD sequence for optimal translation initiation gfpmut3.1 offers an attractive system for monitoring gene expression in S. epidermidis.

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