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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-29999
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2999/


Identifizierung stadienspezifischer Proteine von Leishmania donovani (Ross, 1903) und Charakterisierung einer Amastigoten-spezifischen Thymidin Kinase

Bente, Meike

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Leishmania , Proteom , Thymidin Kinase , stadienspezifisch , 2D-Gelelektrophorese
Basisklassifikation: 42.36 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bruchhaus, Iris (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 31.07.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Das parasitische Protozoon Leishmania donovani, Erreger der viszeralen Leishmaniose, zeichnet sich durch einen biphasischen Lebenszyklus aus. Das begeißelte promastigote Stadium im Insekten-Vektor (Sandmücke: Phlebotomus, Lutzomyia) und das unbegeißelte amastigote Stadium in den Makrophagen des Säugetierwirtes werden durch das Blutmahl des Vektors abgegeben bzw. aufgenommen. Daraufhin erfolgt die Differenzierung in die jeweils andere Form. Für L. donovani ist eine in vitro-Stadiendifferenzierung von Promastigoten zu Amastigoten möglich. Für die Differenzierung, bei der es neben morphologischen zu diversen biochemischen Veränderungen kommt, bedarf es einer fein abgestimmten Regulierung der zahlreichen beteiligten Proteine. Bei den Leishmanien, als Mitglieder der Ordnung Kinetoplastida, findet Genregulation hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene statt. Es ist deshalb sinnvoll und notwendig, die Veränderungen im Expressionsmuster während der Stadiendifferenzierung auf Protein-Ebene und nicht auf RNA-Ebene zu vergleichen.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Proteomanalyse des Parasiten L. donovani während der Differenzierung vom promastigoten zum amastigoten Stadium durchgeführt. Dazu wurden die Proteinverteilungsmuster von L. donovani zu sechs verschiedenen Zeitpunkten der in vitro Stadiendifferenzierung mittels 2D-Gelelektrophorese miteinander verglichen und differentiell synthetisierte Proteine identifiziert. Ausgesuchte Proteine wurden mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert und so über Datenbanken identifiziert. Es konnten etwa 2000 Proteine in den 2D-Gelen dargestellt werden. Bei 94 Protein-spots wurde im Verlauf der Stadiendifferenzierung eine Regulation beobachtet. Für 86 dieser differentiellen Proteine wurden auswertbare Peptidmassenspektren erhalten, die in 71 Fällen zu einer Identifizierung anhand von Datenbankeinträgen führten. Die identifizierten Protein-spots werden durch 56 verschiedene Proteinspezies repräsentiert. Ein Drittel der Proteine zeigte eine Promastigoten-spezifische und zwei Drittel zeigten eine Amastigoten-spezifische Regulation.

Ein Amastigoten-spezifisches Protein wurde näher charakterisiert. Der Peptid-Massen-fingerprint dieses Proteins zeigte eine hohe Homologie zum Genprodukt des im Zuge des L. major Genomprojektes identifizierten Gens einer putativen L. major Thymidin Kinase (TK). Aufgrund dieser Homologie konnte das tk-Gen für L. donovani kloniert und sequenziert werden. Rekombinant exprimiertes rLdTK wurde zur Generierung spezifischer alpha-LdTK-Antikörper in Hühnern eingesetzt. Im Western Blot konnte die in der Proteomanalyse beobachtete Amastigoten-spezifische Regulation der hier untersuchten L. donovani Thymidin Kinase bestätigt werden. Es wurde eine Zunahme der Proteinmenge während der Stadiendifferenzierung von promastigoter zur amastigoter Form nachgewiesen. Es wurde die Lokalisierung des Proteins im Cytosol durch elektronenmikroskopische Untersuchungen sowie Immunfluoreszensanalysen gezeigt. Es zeigte sich, dass das Protein in Promastigoten, in deutlich geringerer Menge als bei Amastigoten, im gesamten Cytosol verteilt vorkommt und es dagegen in den Amastigoten in Gruppen akkumuliert, jedoch ohne Bezug zu einem bestimmten Zellkompartiment.

Durch eine episomale Expression von Ldtk in der Mutante Lm-delta-tk+/n konnten die phänotypischen Merkmale rekonstituiert werden. Auf Ld- und Lm-WT-Zellen hatte die Überexpression des Ldtk keinen Einfluss.

Mittels homologer Rekombination wurden Lm-delta-tk-Deletions-Mutanten generiert, denen ein bzw. beide Allele des tk-Gens fehlten. Die Ein-Allel-Deletions-Mutante Lm-delta-tk+/n hatte im Vergleich zu Wildtyp-Zellen durchschnittlich längere Flagellen. Im Gegensatz dazu zeigte die Null-Mutante jedoch kürzere Flagellen als der WT und zusätzlich eine abgerundete Zellform. Außerdem war hier die Zellteilungsrate stark herabgesetzt. Bei der in vitro Infektion peritonealer Exsudat Zellen konnte bei Inkubation mit der Lm-delta-tk+/n Mutante eine nach 24 Stunden um 30% und nach 48 Stunden um 45% gegenüber dem Wildtyp verringerte Infektiösität gezeigt werden. Die rekonstituierte Mutante Lm-delta-tk+/n rek zeigte hinsichtlich der Anzahl der infizierten Makrophagen keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Infektiösität. Die Auszählung der invadierten Leishmanien pro Makrophage nach 24, 48 und 72 Stunden ergab jedoch, dass das Ausschalten eines tk-Allels im Vergleich zum Wildtyp zu einer deutlich geringeren Anzahl invadierter Leishmanien pro Makrophage führte. Dagegen verhielt sich die rekonstituierte Mutante Lm-delta-tk+/n rek ähnlich dem Wildtyp. Für die Lm-delta-tkn/p-Mutante konnte wegen der geringen Wachstumsrate nicht genügend Zellen generiert werden, um eine repräsenative Auszählung vorzunehmen. Es wurden nur Makrophagen mit 1-2 invadierten Lm-delta-tkn/p-Zellen beobachtet. Die meisten dieser Mutanten hafteten außen an den Makrophagen.



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