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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-30002
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3000/


Lokalisation des humanen Ionenkanals TRPM4 und seine Bedeutung für Membranpotential und Ca2+-Signale

Fliegert, Ralf

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SWD-Schlagwörter: Calcium , Signaltransduktion , Ionenkanal , Membranpotenzial
Freie Schlagwörter (Deutsch): TRPM4 , TRPM2 , ADPR
Freie Schlagwörter (Englisch): Calcium , TRPM4 , signaltransduction , ADPR , TRPM2
Basisklassifikation: 42.15 , 42.13 , 42.17
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Guse, Andreas H. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2005
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 31.07.2006
Kurzfassung auf Deutsch: TRPM2 und TRPM4 sind Mitglieder der Melastatin-Familie der TRP-Ionenkanäle. Für das humane TRPM4-Gen wurden mehrere alternative Transkripte beschrieben. Beim Produkt des Vollängentranskripts TRPM4b handelt es sich um einen Ca2+-aktivierten, spannungsabhängigen Ionenkanal, der für monovalente Kationen, nicht jedoch für Ca2+ permeabel ist. Die Produkte der anderen Splicevarianten sind hingegen bislang kaum charakterisiert worden. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Analyse mittels RT-PCR gezeigt werden, daß HEK-293-Zellen Transkripte der Splicevarianten TRPM4a und TRPM4c coexprimieren. Ein Nachweis endogener Proteine im Westernblot gelang jedoch nicht. Nach Klonierung der cDNA wurden alle drei Isoformen transient als EGFP-Fusionsproteine exprimiert und die Lokalisation in der Zelle durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Während TRPM4b in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert war, fanden sich TRPM4a und TRPM4c überwiegend im ER. Zur funktionellen Analyse wurden HEK-293-Zellinien mit stabiler Überexpression von TRPM4b und TRPM4a generiert. In Zellinien mit stabiler Überexpression des Transkripts für TRPM4c konnte kein entsprechendes Protein nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden in den TRPM4b-exprimierenden Zellen Expression und Lokalisation in der Plasmamembran im Patch-clamp-Experiment durch Nachweis des für TRPM4b charakteristischen Stromes bestätigt. Der Einfluß von TRPM4b auf das Membranpotential und das Ca2+-Signal wurde mit Hilfe fluorimetrischer Methoden untersucht. In den HEK-293-Zellen verringerte die Expression von TRPM4b die Depolarisation der Plasmamembran, die mit dem Ca2+-Einstrom nach Stimulation mit dem Ca2+-Ionophor Ionomycin oder dem ACh-Rezeptor-Agonisten Carbachol einhergeht. In der Folge kam es zu einem stärkeren Einstrom von Ca2+ als in den Wildtyp-Zellen. TRPM4b kann daher in Zellen mit weniger negativem Membranpotential (etwa -15 bis -30 mV in HEK-293-Zellen) als positiver Regulator des Ca2+-Einstroms wirken. In TRPM4a-exprimierenden Zellen setzt die Stimulation mit dem P2Y-Agonisten ATP einen größeren Anteil der intrazellulären Ca2+-Speicher frei als in Wildtyp-Zellen. Der Einfluß von TRPM4a auf die Ca2+-Freisetzung durch Ins-1,4,5-P3 wurde in permeabilisierten Zellen untersucht. Der Einfluß von TRPM4a wurde erst bei Ersatz von K+ durch Cs+ oder nach Inhibition von spezifischen Ca2+-aktivierten K+-Kanälen mit Apamin erkennbar. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß TRPM4a die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern erleichtert, in dem der Aufbau eines höheren ER-Membranpotentials verhindert wird. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, daß es sich bei TRPM4a und TRPM4b um Modulatoren des zellulären Ca2+-Signals handelt. Die Wirkung auf das Ca2+-Signal ist dabei abhängig von der intrazellulären Lokalisation des Kanals. Während TRPM4b in der Plasmamembran, abhängig vom Ruhemembranpotential der Zelle und der mit dem Ca2+-Einstrom einhergehenden Depolarisation, den Ca2+-Einstrom sowohl verstärken als auch reduzieren kann, erleichtert die Expression von TRPM4a in der Membran des ER die Freisetzung von Ca2+. TRPM2 ist ein Ca2+- und Na+-permeabler Ionenkanal, der durch Adenosindiphosphoribose (ADPR) aktivert werden kann. Eine Rolle von ADPR als sekundärer Botenstoff in der Aktivierung des Ca2+-Einstroms wird seit einigen Jahren diskutiert. Für die Analyse des putativen Signalwegs standen bisher keine ausreichend spezifischen Pharmaka zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit wurde im Patch-clamp-Experiment die endogene Expression von TRPM2 in Jurkat T-Lymphozyten bestätigt. In diesem System wurde die Wirkung des NAD-Glykohydrolase-Inhibitors 3GA, sowie von 8-Br-ADPR auf TRPM2 untersucht. Während 3GA in Konzentrationen, die die zelluläre Bildung von ADPR inhibieren, keinen Einfluß auf die Aktivierung von TRPM2 hatte, inhibierte 8-Br-ADPR die ADPR-vermittelte Aktivierung von TRPM2 vollständig. Mit 3GA und 8-Br-ADPR stehen damit erstmals zwei Pharmaka zur Verfügung, die die Unterbrechung eines möglichen ADPR/TRPM2-Signalweges an unterschiedlichen Stellen erlauben. In Zukunft sollen diese Substanzen für die Untersuchung der Beteiligung dieses Signalweges an physiologischen Vorgängen eingesetzt werden. Die Teilprojekte zu TRPM4 und TRPM2 tragen zu unserem Verständnis der Rolle der sehr heterogenen Familie der TRPM-Kanäle an der Modulation des zellulären Ca2+-Signals bei. Die funktionellen Unterschiede zwischen TRPM4a und TRPM4b machen deutlich, wie wichtig dabei das Wissen um Expression und Eigenschaften von Splicevarianten ist. Aufgrund des Fehlens spezifischer Inhibitoren und Agonisten hat sich unser Wissen über TRPM-Kanäle bislang im wesentlichen auf Erkenntnisse aus Überexpressionsstudien beschränkt. Die Verwendung spezifischer Inhibitoren wie 3GA und 8-Br-ADPR wird in Zukunft die Analyse der Rolle von TRPM-Kanälen und der an ihrer Aktivierung beteiligten Signaltransduktionswege in intakten Zellen und nativen Geweben ermöglichen.

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