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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-30095
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3009/


Charakterisierung von Allergenen der Litchi

Characterisation of Lychee Allergens

Hoppe, Sonja

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SWD-Schlagwörter: Lebensmittelallergie , Litschi , Charakterisierung , Allergen , Identifikation , Isolierung <Chemie>
Basisklassifikation: 58.34
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Steinhart, Hans (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 01.08.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Allergenspektrums der Litchi sowie die Isolierung und Identifizierung ausgewählter Allergene. Außerdem sollte die Stabilität einzelner Litchiallergene gegenüber einer in-vitro Verdauung untersucht werden.

Die Charakterisierung des Allergenspektrums erfolgte mittels Immunoblot nach vorangestellter Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Isoelektrischer Fokussierung und zweidimensionaler Elektrophorese unter Verwendung von 39 Patientenseren.
Mehr als die Hälfte der Seren detektierte Allergene mit Molekulargewichten von 28, 35, 40, 43, 55 und 70 kDa. Sie sind somit potenzielle Hauptallergene der Frucht. Besonders das 55 kDa Allergen, dass von 92 % der Seren detektiert wurde, ist von großer Bedeutung. Außerdem werden Allergene mit Molekulargewichten von 14, 25, 32, 60, 65 kDa und im Bereich größer 70 kDa nachgewiesen. Auffällig ist, dass die Mehrheit der Allergene einen isoelektrischen Punkt im sauren Bereich zwischen ca. 4.0 und 5.2 aufweist.

Des Weiteren sollte geklärt werden, ob in der Litchi Glycoproteine vorliegen und ob diese an der IgE-Bindungsfähigkeit der Allergene beteiligt sind. Im elektrophoretisch getrennten Proteinextrakt wurden nach Spaltung mit Periodat mit dem Schiffschen Reagenz Glycoproteine nachgewiesen. Als Zuckerreste liegen alpha-D-Mannose oder alpha-D-Glucose, alpha-L-Fucose und N-Acetylglucosamin nicht aber D-Galactose vor. Diese Reste konnten durch Bindung an Lectine entsprechender Spezifität im Lectinblot nachgewiesen werden. Weiterhin wurden die Allergene nach Periodatbehandlung auf einer Nitrocellulose-Membran immungefärbt. Die Untersuchungen führen zu dem Ergebnis, dass eine Beteiligung der Kohlenhydratreste an der Antikörperbindung einiger Allergene im Molekulargewichtsbereich größer 43 kDa möglich ist.

Außerdem konnte das kreuzreaktive Profilin nach Trennung mittels Ionenaustauschchromatographie in zwei Isoformen mit isoelektrischen Punkten von ca. 4.3 und 3.9 nachgewiesen werden. Kein anderes Allergen der Litchi trägt Epitope des Profilins, was durch Immunoblot-Inhibitionsversuche nach Trennung des Profilins von den anderen Litchiallergenen mittels Gelpermeationschromatographie gezeigt werden konnte.

Für die Isolierung der Litchiallergene wurden verschiedene chromatographische Methoden und eine fraktionierte Fällung eingesetzt. Die Methoden der Ammoniumsulfatfällung, Gelpermeations-, Affinitäts-, Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie wurden auf ihre Eignung, das vorliegende Gemisch aufzutrennen, untersucht. Es zeigte sich, dass mit Hilfe der Anionenaustauschchromatographie die besten Ergebnisse erzielt werden können. Die Allergene mit Molekulargewichten von 25, 28, 32, 55 und 70 kDa standen nach vorangegangener Aufreinigung mittels Ionenaustauschchromatographie für weitere Untersuchungen wie eine Identifizierung oder in-vitro Verdauung zur Verfügung.

Für die in-vitro Verdauung wurden die Allergene mit Molekulargewichten von 14, 25, 28, 55 und 70 kDa eingesetzt. Mit Ausnahme des Profilins zeigten alle Allergene bzw. deren Spaltprodukte nach der Magenverdauung allergenes Potenzial. Dabei lag lediglich das 55 kDa Allergen als intaktes Molekül nach der Magenverdauung vor. Alle anderen Allergene wurden in kleine Fragmente gespalten. Die in-vitro Darmverdauung resultierte in einer Spaltung aller nativen Allergene. Trotzdem konnte nach allen Verdauungsschritten allergenes Potenzial nachgewiesen werden.

Die Identifizierung der Allergene mit Molekulargewichten von 25, 28 und 32 kDa gelang mit der N-terminalen Sequenzierung. Die Identität des 28 kDa Allergens wurde zusätzlich durch die Bestimmung des Peptide Mass Fingerprint bestätigt. Das 55 kDa Allergen, dessen Sequenz aufgrund einer Blockierung nicht mittels Edman-Abbau bestimmt werden konnte, wurde mit einem MALDI-TOF/TOF nach tryptischem Verdau vermessen. Auf diese Weise konnten zwei Peptide sequenziert werden, die eine Identifizierung ermöglichten.

Die N-terminale Sequenz des 25 kDa Allergens zeigte eine hohe Übereinstimmung mit dem NtPRp27-like Protein der Kartoffel und liegt in der Litchi in Form von drei Isoallergenen mit isoelektrischen Punkten von 7.37, 7.04 und 7.01 vor. Dieses Protein wurde in der Literatur noch nicht als Allergen genannt.
Auch das 28 kDa Allergen konnte in zwei Isoformen in der Frucht nachgewiesen werden (pI: 7.37 und 7.01). Es zeigt eine große Homologie zu Triosephosphat-Isomerasen verschiedener pflanzlicher Herkunft. Dieses Protein wurde bereits in Weizen und Latex als Allergen identifiziert.
Das 32 kDa Allergen zeigt eine auffällige Homologie zu einem Chinon-Reduktase-Homolog, das noch nicht als Allergen beschrieben wurde.
Das nach MALDI-TOF/TOF identifizierte 55 kDa Allergen weist eine starke Übereinstimmung mit Methioninsynthasen verschiedener Pflanzen auf. Eine Methioninsynthase wurde im Zusammenhang von Allergien gegen Raps beschrieben.
Kurzfassung auf Englisch: Aim of this study was the characterisation of the allergen spectrum of the lychee as well as the isolation and identification of some of these allergens. Additionally the stability of the allergens during in-vitro digestion was investigated.

The allergen spectrum was characterised by immuno blot after sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focussing and two dimensional electrophoresis using sera of 39 patients suffering from lychee allergy. Due to the fact that more than 50 % of the sera detected the allergens with molecular weights of 28, 35, 40, 43, 55 and 70 kDa these allergens are potential main allergens of the fruit. Especially the 55 kDa allergen is very important as it was detected by 92 % of the sera. Additionally allergens with molecular weights of 14, 25, 32, 60, 65 and >70 kDa were evidenced. Noticable is the fact that the majority of the allergens has an acidic isoelectric point between 4.0 and 5.2.

Furthermore the occurrence of glycoproteins in the lychee and their contribution to the IgE-binding was investigated. For this purpose different methods were applied. In the electrophoretically separated protein extract a multitude of glycoproteins were detected using the Schiff‘s reagent which is based on decomposition with periodate. Residues in the form of alpha-D-mannose or alpha-D-glucose, alpha-L-fucose and n-acetylglucosamin, but not D-galactose were found. These carbohydrates were proven by means of lectin blot with suitable lectins.

Moreover the cross-reactive profilin was evidenced after purification by ion exchange chromatography in two isoforms with isoelectric points of 4.3 and 3.9. No other allergen of the lychee shows epitopes of the profilin which was proven by means of immunoblot inhibition after separation of the profilin from the other lychee allergens by gel permeation chromatography.

For the isolation of the lychee allergens different chromatographic methods and a fractionated precipitation were utilised. The ammoniumsulfate precipitation, gel permeation chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography and the reversed phase chromatography were tested for their suitability to separate the complex mixture. The anion exchange chromatography showed the best results. The allergens with molecular weights of 25, 28, 32, 55 and 70 kDa were purified by ion exchange chromatography and used for further investigation.

For in-vitro digestion the allergens with molecular weights of 14, 25, 28, 55 and 70 kDa were used. After the gastric digestion all allergens or the generated peptides showed allergenic potentcy, only the profilin did not. The 55 kDa allergen was the only persistent allergen after the gastric digestion, all other allergens were decomposed into smaller fragments. After the in-vitro intestinal digestion all allergens were fragmented, though after all steps of the digestion allergenic potentcy was still present.

The identification of the allergens with molecular weights of 25, 28 and 32 kDa were achieved by means of N-terminal sequencing. The identity of the 28 kDa allergen was confirmed by peptide mass fingerprint. The 55 kDa allergen could not be investigated by Edman degradation because of blocking of the N-terminus. For that reason the allergen was analysed by MALDI-TOF/TOF after tryptic digestion in gel. Thus two peptides could be sequenced which made an identification possible.

The N-terminal sequence of the 25 kDa allergen shows a high similarity to the NtPRp27-like protein of potato and three isoallergens with isoelectric point of 7.37, 7.04 and 7.01 were found in the lychee. This protein was not mentioned in the content of allergy in the literature so far.
The 28 kDa allergen was also proven in two isoforms with isoelectric point of 7.37 and 7.01. A high homology to triose phosphate isomerases from several plant origins was determined. This protein was already identified as an allergen in wheat and latex.
The 32 kDa allergen has a noticeable homology with a quinone reductase homolog that has not been described as an allergen until now.
The 55 kDa allergen that was identified by MALDI-TOF/TOF shows a high similarity with methionine synthases of various plants. A methionine synthases was described in regard to allergies against rape.

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