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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-30140
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3014/


Zur Phagozytose durch Retinale Pigmentepithelzellen

Phagocytosis by Retinal Pigment Epithelial Cells

Karl, Mike O.

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SWD-Schlagwörter: Netzhaut , Netzhautdegeneration , Phagozytose , Calciumkanal , Spannungskontrollierter Ionenkanal , Calcium , Protein-Tyrosin-Kinasen , Pigmentepithel
Freie Schlagwörter (Deutsch): c-mer , MerTK , Gas6 , growth arrest factor 6 , RPE
Freie Schlagwörter (Englisch): c-mer , MerTK , Gas6 , growth arrest factor 6 , RPE
Basisklassifikation: 44.37 , 42.12 , 42.15 , 44.30 , 44.95
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Engelmann, Katrin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.04.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 07.08.2006
Kurzfassung auf Deutsch: ZUSAMMENFASSUNG
Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit stellen I) die Etablierung eines optimierten Phagozytoseassays zur Untersuchung mehrerer Variablen der Photorezeptoraußensegment (OS) Anbindung und Aufnahme, II) die Validierung und Charakterisierung einer SV40 transfizierten humanen RPE Zellinie hinsichtlich der Phagozytosefunktion in vitro, III) die ausführliche Prüfung von Zellkulturmedien und komplexer Supplemente, letztere hergestellt aus der apikalen (Retinaextrakt) und basalen (choroideakonditioniertes Medium) Nachbarstruktur des RPE, auf die Phagozytose in vitro sowie IV) Untersuchungen zur Patho- /Physiologie der OS Phagozytose durch RPE und RCS-RPE Zellen dar. Im Detail: 1) Serumfreie Zellkulturmedien beeinflussen die Phagozytose: hSFM > SFM > DMEM, MEM > F99. 2) Choroideakonditioniertes Medium (ChCM) verrringert die Phagozytose konzentrationsabhängig. 3) Supplementierung mit 1 % Retinaextrakt steigert, aber 5 und 10 % mindern die Phagozytose. 4) Supplementierung des Medium F99 mit 10 % FCS steigert, zusätzliches Insulin und Pyruvat verringert die Phagozytose. Weitere Zugabe von 15 % ChCM unterdrücken den Serumeffekt, wohingegen 1 % RE anstatt 15 % ChCM stimulierend wirkt. 5) Es konnten verschiedene neue potentielle Teilnehmer an der Signaltransduktion der Phagozytose von Photorezeptoraußensegmenten (OS) des retinalen Pigmentepithel (RPE) identifiziert werden. 6) Ferner wurden Daten an RPE Zellen der RCS-Ratte gewonnen, einem Tiermodell für eine auch beim Menschen beschriebene hereditäre Retinadegeneration bedingt durch Phagozytosedefekt des RPE. Der Vergleich nativer (Kontroll-RPE) und dystropher (RCS-RPE) Zellen gab neue Aufschlüsse über die Interaktion der modulierenden Signalpartner und außerdem weitere Einblicke in die Pathophysiologie dieser Retinadegeneration. 7) MerTK und Gas6 werden im humanen RPE exprimiert. MerTK Antikörper reduzieren die Phagozytose und der die Phagozytose stimulierende Serumeinfluss ist nur partiell durch Gas6 vermittelt. 8) Weiterhin konnte die Beteiligung von L-Typ Ca2+ Kanälen an der Phagozytose durch RPE Zellen beobachtet werden. Die Blockierung der Kanäle reduziert OS Anbindungs- und Aufnahme an Kontrollzellen. An RCS-RPE Zellen führt die Inhibierung der Kanäle zur Stimulation der Phagozytose. 9) Zwei potentielle Modulatoren von L-Typ Ca2+ Kanälen am RPE, extrazellulär der Wachstumsfaktor bFGF und intrazellulär die pp60c-src Tyrosinkinase, sind beteiligt an der Phagozytoseregulation. 10) An RPE Kontrollzellen weist bFGF in Abhängigkeit der Applikationszeit und der OS Expositionzeit komplexe Effekte von inhibierender wie auch stimulierender Wirkung beider Phagozytosephasen auf. Die bFGF Applikation führt zur Stimulation der Phagozytose durch RCS-RPE Zellen. 11) Die Inhibition von pp60c src Tyrosinkinasen führt zum Verlust der serumstimulierten und –freien Phagozytose bei gleichzeitiger Reduktion der OS Anbindungskapazität durch RPE Kontrollzellen. Dieser Einfluss wurde auch an MerTK defizienten RCS RPE Zellen ermittelt. 12) Die hier dargestellten Ergebnisse deuten auf eine integrative Funktion von L-Typ Ca2+ Kanälen an der Modulation der Ca2+ Homöostase hin. Diese ist bei einer Form der retinalen Degeneration aufgrund defizienter MerTK nicht mehr gewährleistet. Damit sind L-Typ Ca2+ Kanäle potentiell in Prozessen der Phagozytoseregulation in RPE Zellen involviert.
Kurzfassung auf Englisch: SUMMARY
The major findings in this work are: I) the establishment of an optimized high-throughput assay for photoreceptor outer segment (OS) binding and uptake by retinal pigment epithelium (RPE) in vitro, II) the validation and characterization of phagocytosis by an SV40 transfected human RPE cell line, III) detailed in vitro testing for effects on phagocytosis of cell culture media and complex supplements that were produced from tissue adjacent apical (retinal extract) and basolateral (choriod conditioned media) of RPE, as well as IV) research into the patho- /physiology of OS phagocytosis by RPE and MerTK-deficient RPE (RCS rat).
The findings in detail are: 1) Serum-free cell culture media alter phagocytosis: hSFM > SFM > DMEM, MEM > F99; 2) Choroid conditioned media (ChCM) reduces phagocytosis dose dependently; 3) Supplementation with 1% retina extract (RE) stimulates phagocytosis, but 5 and 10% RE reduce it; 4) Supplementation of medium F99 with 10% FCS increases phagocytosis and adding further insulin and pyruvate reduces phagocytosis; moreover, further addition of 15% ChCM supresses the stimulating serum effect, whereas 1% RE instead of 15% ChCM has a stimulating effect; 5) Various new potential signal transduction modulators of OS phagocytosis by RPE were identified; 6) Phagocytosis was studied in RCS rat RPE (animal model of retina degeneration caused by phagocytic deficiency due to a mutation in receptor tyrosine kinase Mer (MerTK); this mutations is also found in humans); comparing phagocytosis in physiological (wild-type RPE) and pathophysiological settings (RCS RPE) led to more insight into the underlying signalling pathways; 7) MerTK and Gas6 expression were identified in human RPE; MerTK antibodies reduce phagocytosis and the serum stimulating effect only partially depends on Gas6; 8) L-type calcium channel inhibition reduces wild-type RPE phagocytosis in binding and uptake; contrarily, blocking calcium channels in RCS-RPE stimulates phagocytosis; 9) Two potential signal transduction partners of L-type channels are modulating RPE phagocytosis: basic fibroblast growth factor (bFGF) extracellularly and tyrosine kinase pp60c-src intracellularly; 9) In wild-type RPE, bFGF has complex effects (stimulating or inhibiting) on phagocytic binding and uptake depending on bFGF preincubation times and OS challenge duration; in RCS-RPE, bFGF application stimulates phagocytosis; 10) Inhibition of pp60c src abolishes serum-free and serum stimulated phagocytic binding and uptake of OS by wild-type RPE; phagocytosis of MerTK-deficient RCS-RPE is likewise inhibited.12) Collectively, these studies suggest an integrative role for L type calcium ion channels modulating calcium homeostasis and phagocytic response by RPE cells. Their regulation is decoupled in a specific form of retinal degeneration due to MerTK-deficient RPE. Therefore, L type calcium channels potentially participate in the regulation of RPE phagocytosis.

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