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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-30192
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3019/


Analyse der Dephosphorylierung des Entenhepatitis B-Virus Nukleokapsidproteins : Einfluss auf Replikation und Infektiosität

Franke, Claudia

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SWD-Schlagwörter: Phosphorylierung , Dephosphorylierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Enten-Hepatits-B-Virus (DHBV) , Kapsidprotein
Basisklassifikation: 42.13 , 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Will, Hans Kilian (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 08.08.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Das Nukleokapsidprotein (DHBc) des Entenhepatitis B-Virus (DHBV) unterliegt einer reversiblen Phosphorylierung an mindestens 6 Serin/Threoninseitenketten durch Enzyme der Wirtszelle. Vor Beginn und während der Entstehung dieser Arbeit publizierte Funktionsanalysen, insbesondere mit Kapsidprotein-Phosphorylierungsmimikrymutanten, deuteten darauf hin, dass der Phosphorylierungsstatus wichtige Funktionen für die Koordinierung der (D)HBV-Replikation hat. Der die Reifung der DHBV-Virionen begleitende Übergang von hyperphosphoryliertem zu hypophosphoryliertem Kapsidprotein impliziert eine wichtige Rolle für Phosphatasen im Lebenszyklus des DHBV.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten diese Hinweise in Zelllinien und primären Entenleberzellkulturen (PDLCs) in einem unabhängigen experimentellen Ansatz überprüft und ergänzt werden. Hierzu sollte insbesondere nach zellulären Phosphatasen gesucht werden, die an der Dephosphorylierung von DHBc beteiligt sein könnten und in Hepatozyten oder Hepatomzelllinien exprimiert werden. Phosphataseaktivitäten sollten durch spezifische Inhibitoren oder durch Überexpression von konstitutiv aktiven oder dominant negativen Enzymen moduliert werden und anschließend die Konsequenzen für den intrazellulären Phosphorylierungsstatus von DHBc sowie für die virale Replikation analysiert werden. Aufgrund von zu Beginn der Arbeit vorliegenden Daten wurden vor allem die Funktionen von Calcineurin (CN) und, basierend auf eigenen Sequenzmotivanalysen, zusätzlich die von Proteinphosphatase 2A (PP2A) als potentiellen DHBc-Phosphatasen analysiert.
Die Überexpression beider Phosphatasen in Zelllinien führte zu einer DHBc-Hypophosphorylierung. Koexpression von konstitutiv aktivem CNA (CNmut) zusammen mit replikationskompetenten Genomen von DHBV in der humanen Hepatomzelllinie HuH7 führte zu einer hoch-effizienten DHBc-Dephosphorylierung, hatte jedoch keinen Effekt auf die virale Proteinexpression, DNA-Synthese, Formation und Sekretion von viralen Partikeln sowie die Infektiosität der Virionen in PDLCs.
Die Überexpression von PP2A führte ebenfalls zu einer DHBc-Dephosphorylierung. Verglichen mit Calcineurin war der Effekt geringer, jedoch assoziiert mit einer 3-fachen Reduktion von intrazellulärer viraler DNA, von sekretierten viralen Partikeln und einer entsprechend verminderten Zahl von infizierten Hepatozyten in PDLCs. Die Überexpression einer dominant-negativen Form der PP2A (PP2Adn) führte zu einer geringfügig gesteigerten DHBc-Phosphorylierung. Damit verbunden war ein 3-facher Anstieg der Menge an sekretierten Virionen. Die Menge an intrazellulärer Virus-DNA und die Anzahl infizierter Hepatozyten blieben dabei unverändert.
Die Ergebnisse der Dephosphorylierungsstudien mit CNmut und PP2A wiesen darauf hin, dass diese Enzyme unterschiedliche Phosphorylierungsstellen betreffen. Um dies zu belegen, wurden die Effekte der jeweiligen Phosphatasen auf individuelle Phosphorylierungsstellen des DHBc analysiert. Hierfür wurden Antikörper gegen entsprechende Phosphopeptide produziert. Für jede Phosphorylierungsstelle wurde mindestens ein Antiserum erhalten, welches das phosphorylierte DHBc-Sequenzmotiv mit sehr hoher Präferenz gegenüber dem Nicht-Phosphopeptid erkennt, gezeigt durch Verwendung von Phosphatase-behandelten Immunblots und in ELISAs. Die Ergebnisse mit diesen Antiseren verdeutlichten, dass die durch CNmut vermittelte starke DHBc-Dephosphorylierung zwar alle bekannten Phosphorylierungsstellen betrifft, die Positionen S232, S245, S257 und S259 jedoch bevorzugt. Eine trotz hoher CNmut-Expression vorhandene, geringe restliche DHBc-Phosphorylierung schien fast ausschließlich auf DHBc mit jeweils einer einzigen phosphorylierten Position zu beruhen. Die Analyse der PP2A-induzierten DHBc-Hypophosphorylierung mit den Peptidantiseren spricht für eine präferentielle Dephosphorylierung an den Positionen S232, S257 und S259, eine etwas geringere Dephosphorylierung an der Position S245 und weitgehende Resistenz der Phosphate an den Positionen T239 und S230. Besonders auffällig bei der PP2A-Koexpression war der Verlust an Einfachphosphorylierung an DHBc-T239. Phosphoryliertes T239 trat hier nur noch zusammen mit anderen Phosphorylierungen am selben Kapsidprotein zusammen auf, anscheinend hauptsächlich an der Position S245.
Zusammenfassend sprechen die erhaltenen Ergebnisse dafür, dass die Serin/Threonin-Phosphorylierung des Nukleokapsids für eine effiziente und infektionskompetente Viruspartikelproduktion von DHBV weitgehend, wenn nicht sogar vollkommen entbehrlich ist. Die offensichtlichen Widersprüche zu den Schlussfolgerungen aus Experimenten mit Virusmutanten sind möglicherweise auf strukturelle und/oder funktionelle Effekte der artifiziell eingeführten DHBc-Aminosäureaustausche in früheren Publikationen zurückzuführen.

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