Untersuchung zur Methicillinresistenz bei sechs biofilm-negativen Tn917-Transposonmutanten des Staphylococcus epidermidis-Stammes 1057

Abstract

Biofilmbildung und Methicillinresistenz stellen zwei wesentliche Pathogenitätsfaktoren von S. epidermidis dar. Der icaADBC-Genlokus ist als genetisches Korrelat für Biofilmbildung und PIA-Produktion bei S. epidermidis und S. aureus identifiziert worden. Grundlage dieser Arbeit bildeten sechs verschiedene Tn917-Mutantenklassen des methicillinsensiblen, mecA-negativen S. epidermidis-Stammes 1457, die alle direkt oder indirekt regulativ die Transkription des icaADBC-Genlokus beeinflussen. Die Transposoninsertionslokalisationen M10, M13 (Klasse I), M12 (Klasse II), M15 (Klasse III), M17 (Klasse IV), M16 (Klasse V) und M20 (Klasse VI) wurden in dieser Arbeit von S. epidermidis 1457 in den methicillinresistenten, mecA-positiven S. epidermidis-Stamm 1057 transduziert. Das phänotypische Profil der resultierenden 1057-Transduktanten entsprach dem der korrespondierenden 1457 Mutanten. Southernblot-Hybridisierungen mit einer Tn917-spezifischen Sonde zeigten Tn917-Insertionen auf identischen EcoRI-Fragmenten der 1057- und 1457- Transduktanten. Eine mecA-spezifische Sonde hybridisierte mit den gleichen DNA-Fragmenten EcoRI- gespaltenerDNA von S. epidermidis 1057 und allen in dieser Arbeit geschaffenen 1057-Transduktanten. In Populationsanalysen auf oxacillinhaltigen Müller-Hinton-Agarplatten zeigte S. epidermidis das für mecA positive Stämme typische heterogene Resistenzmuster mit einer MHK ≥ 6 µg/ml für 90 % aller Zellen. Die Populationsanalysen der Klasse I, V und VI Transduktanten entsprachen denen des Wildtypstammes. Die Klasse III Transduktante 1057M15 zeigte eine signifikante Zunahme sensiblerer Subpopulation mit einer Reduktion der MHK auf ≤ 1µg/ml für 90 % der Zellen. Die Klasse IV Transdukante 1057M17 exprimierte ein homogenes Resistenzprofil mit einer MHK von ≥ 50 µg/ml für 90 % aller Zellen. Vergleichende Resistenzprüfungen des Wildtypstammes und aller Transduktanten auf Oxacillingradientenplatten erbrachten die gleichen Ergebnisse. Die mittels Populationsanalyse nicht charakterisierte Klasse II Transdukante 1057M12 zeigte auf den Gradientenplatten ein signifikant vermindertes Wachstum im Vergleich zum Wildtypstamm. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass (i) die in dieser Arbeit verwendeten Tn917-Insertionen in mehreren unabhängigen S. epidermidis-Stämmen die gleichen Phänotypänderungen induzieren und dass (ii) drei Tn917-Insertionslokalisationen, welche die Expression von icaADBC auf transkriptioneller Ebene beeinflussen, zu signifikanten Veränderungen der Methicillinresistenz führen.

Biofilm formation and methicillin resistence are two important virulence factors of S. epidermidis. Biofilm formation and PIA production are coded by the icaADBC gene cluster. We isolated in previous studies several transposon mutants of the biofilm positive staphylococcus (s.) epidermidis strain 1457. According to phenotype and genotype characteristics we seperated the mutants in six different classes: M10, M13 (class I), M12 (class II), M15 (class III), M17 (class IV), M16 (class V) und M20 (class VI). All of these insertions affect icaADBC transcription directly or indirectly. For this study we transferred six TN917 transposon insertions from the biofilm positive, methicillin sensible s. epididermidis strain 1457 in the methicillin resistant, mecA and biofilm positive s. epdidermidis strain 1057 using phage 71. Southern-Blot-hybridization with a TN917 specific probe showed TN917 insertion in identical DNA-fragments of EcoRI-digested DNA of 1057 transductants and 1457 mutants. A mecA specific probe hibridized with the same EcoRI-DNA-fragments of DNA of the 1057 parent strain (1057wt)and all of the 1057 transductants. All transductants of S. epidermidis 1057 expressed similar biofilm formation like the corresponding mutants of S. epidermidis 1457.On population analysis S. epidermidis 1057wt showed a heterogenous expression type of methicillin resistance with an oxacillin MIC of >= 6µg/ml for more than 90% of the cells. The class I (1057M10, 1057M13), class V (1057M16)and class VI (1057M20) transductants displayed an identical profile. The class III transductant 1057M15 showed a significant shift to more sensible cell populations (oxacillin MIC<=1µg/ml for more than 90% of all cells). The class IV transductant 1057M17 expressed a homogeneous population profile with a MIC of >=50 µg/ml for more than 90% of the cells. Analysis of the transductants on oxacillin gradient plates displayed the same changes in oxacillin resistence as described with population analysis. The class II transductant 1057M12 couldn't be analysed with population analysis and showed on gradient plates a decreased expression of oxacallin resistance. With this work we showed that(i)the used Tn917 insertions induce the same phenotype changes in different s. epidermidis strains and that (ii) three Tn917 insertions, which influence the expression of icaADBC on transcriptional level, lead to significant changes in methicillin resistance.