Identifizierung und Charakterisierung von gewebsspaltenden Proteinasen bei parasitären Nematoden

Abstract

Onchozerkose ist eine Haut- und Augenkrankheit, die von der Filarie Onchocerca volvulus verursacht wird. Der adulte Parasit lebt in subkutanen Knoten, aus denen die Larven (Mikrofilarien) zur Haut wandern. Für diese Gewebswanderung benötigt der Parasit gewebsspaltende Proteinasen wie Metall- und Serinproteinasen. Haffner et al. zeigten 1998, dass die Überstände der wandernden Stadien von O. volvulus proteolytische Aktivitäten mit molekularen Massen von circa 28 und 52 kDa enthalten.

Um die Sequenzinformationen über die Gene, die für diese Proteinasen kodieren, zu erhalten, wurde die NCBI Datenbank nach Expressed Sequence Tags durchsucht. Ein EST mit Homologie zu Metallproteinasen diente als Vorlage zur Entwicklung von Oligonukleotiden, mit deren Hilfe PCRs zur Amplifikation des Volllängenklons durchgeführt wurden. Der offene Leserahmen umfasst 1716 bp und kodiert für eine Metallproteinase, die aus 571 Aminosäuren besteht und ein theoretisches Molekulargewicht von 66 kDa hat. Sie gehört zur Familie der Astacin-artigen Metallproteinasen, die bereits bei mehreren parasitären Nematoden charakterisiert worden sind, wie zum Beispiel Ancylostoma caninum, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Ostertagia ostertagi. Das Protein wurde in mehreren prokaryotischen Expressionssystemen, sowie im Baculovirussystem exprimiert und proteolytisch charakterisiert. Es wurden Antikörper in Kaninchen generiert und die Immunantwort von Onchozerkose-Patienten wurde untersucht. Das O. volvulus Astacin (im Folgenden als Onchoastacin bezeichnet) wird durch Trypsin aktiviert und spaltet Komponenten der extrazellulären Matrix wie Fibronektin. Es ist gegenüber dem Metallproteinase-Inhibitor Phenanthrolin sensitiv. Onchozerkose-Patienten zeigten im Unterschied zu nicht infizierten Europäern eine IgG-Antwort. Das Onchoastacin ließ sich in reifen Mikrofilarien nachweisen, nicht aber in Weibchen oder intrauterinen Mikrofilarien. Durch RT-PCR wurde ein weiteres Astacin aus dem Nager-Parasiten Strongyloides ratti identifiziert. Dieser Parasit zeichnet sich durch das Fehlen eines Zwischenwirts aus und durch das Vorkommen sowohl eines parasitären als auch eines freilebenden Zyklus. Der Zugang zu parasitären wie freilebenden Stadien ist im Rattenmodell gewährleistet. Die Identifizierung des S. ratti-Astacins stellt den Anfang zu vergleichenden Expressionsstudien von parasitären und freilebenden Stadien dar. Um die zweite beobachtete proteolytische Aktivität in den O. volvulus Kulturüberständen aufzuklären, eine Serinproteinase aus der nah verwandten Filarie Brugia malayi identifiziert. B. malayi wurde gewählt, da in den Datenbanken keine Sequenzinformationen zu O. volvulus-Serinproteinasen gefunden wurden. Hier wurde ebenfalls auf der Basis eines EST´s eine DIG-markierte Sonde generiert, mit der eine cDNA-Bank von B. malayi-Männchen gemustert wurde. Es ergab sich ein offener Leserahmen mit einer Länge von 816 bp identifiziert, der für eine Trypsin-artige Serinproteinase mit einem errechneten Molekulargewicht von 30 kDa kodiert. Das Protein wurde prokaryotisch exprimiert und es wurden Antikörper hergestellt. Die Identifizierung und Charakterisierung von gewebsspaltenden Proteinasen von parasitären Nematoden kann eine Grundlage zur Herstellung von Inhibitoren mit chemotherapeutischem Potenzial sein. Außerdem können diese exkretorisch/sekretorischen Produkte Ziele für die Entwicklung eines Impfstoffs darstellen.

Onchocerciasis is a parasitic skin and eye disease caused by the filarial parasite O. volvulus. The adult parasites live in subcutaneous nodules from where the microfilariae migrate back into the skin. For migration the parasite utilizes tissue-degrading enzymes like matrix metallo and serine proteases. Thus, excretory-secretory products of the migrating stages were shown to contain distinct proteolytic components with molecular masses of about 28 and 52 kDa. In order to identify the cDNAs encoding for these proteases, the public data bases were searched. Among 10,000 expressed sequence tags of O. volvulus two clones similar to a metalloprotease were identified. A PCR approach was used to obtain the full length clone, which comprises 1712 bp. The protein shows high homologies to members of the astacin family of metalloproteases, e.g. Trichinella spiralis (58%) and Strongyloides stercoralis (32%). Onchoastacin recombinantly expressed in the baculovirus system showed enzymatic activity in different assays. Immunolocalization and functional analysis showed that Onchoastacin is expressed in mature migrating microfilariae. Furthermore, based on sequence information of a Brugia malayi-EST (third stage-larvae library) a Digoxigenin-labeled probe was generated. It was used to screen a B. malayi-cDNA-library and an open reading frame with 816 bp of a putative trypsin-like serine protease was obtained. Antibodies were generated for immunolocalization and screening of O. volvulus-libraries for homolog proteins. The identification and cloning of matrix-degrading proteases of O. volvulus can allow the design of specific inhibitors with chemotherapeutic potential. These evasion factors may represent also targets for the development of a vaccine.