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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-30794
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3079/


Die Reparatur Topoisomerase IIalpha-Inhibitor-induzierter DNA-Doppelstrangbrüche und ihre Bedeutung für die Therapie

The repair of topoisomerase IIalpha-inhibitor induced DNA double-strand breaks and its influence on therapy

Schonn, Ilona

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SWD-Schlagwörter: Pharmazie , Klinische Pharmazie , DNS-Reparatur , Dickdarmkrebs , Apoptosis , Etoposid , Doxorubicin
Freie Schlagwörter (Deutsch): Topoisomerase
Freie Schlagwörter (Englisch): topoisomerase
Basisklassifikation: 44.40 , 44.41 , 44.81
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dartsch, Dorothee (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 31.10.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit die DNA-Reparatur eine Bedeutung für die Resistenzentwicklung von soliden Tumoren gegenüber Topo IIa-Inhibitoren hat. Die Untersuchung erfolgte in vitro an Kolonkarzinomzellen der Linie HT-29 und primären Zellen aus der Ascitesflüssigkeit zweier Tumorpatienten. Als Modellsubstanzen wurden DOX und ETO verwendet, die in Anlehnung an in verschiedenen Therapieprotokollen erreichte Plasmaspiegel in unterschiedlichen Konzentrationen und über verschiedene Zeiten eingesetzt wurden.

Die Ergebnisse bestätigten, dass DOX und ETO DNA-Doppelstrangbrüche induzieren. Weitere Effekte der Behandlung waren eine dauerhafte Blockade des Zellzyklus in der G2/M-Phase, die Erhöhung des Rad51-Spiegels, die Reparatur der Strangbrüche sowie die Induktion des programmierten Zelltods. Infolge der beschriebenen Effekte war die Koloniebildung der HT 29-Zellen inhibiert, wobei eine negative Korrelation mit dem Anteil der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus 24 Stunden nach der zytostatischen Behandlung bestand. Daher wird postuliert, dass die Entscheidung über das Schicksal der Zelle in diesen ersten 24 Stunden fällt. Eine Sonderrolle nahm die Behandlung mit ETO in niedriger Konzentration und für kurze Zeit ein. Hierdurch wurde weder der Zellzyklus blockiert noch das Koloniewachstum gehemmt, obwohl sich die Höhe des DNA-Schadens und der Reparaturverlauf nicht von der Behandlung mit zehnfach höherer ETO-Konzentration unterschieden. Es wird daher angenommen, dass der Zellzyklusarrest außer durch die Zahl der Doppelstrangbrüche von weiteren Faktoren beeinflusst wird.
Zudem wurde gezeigt, dass die Reparatur der durch DOX induzierten Doppelstrangbrüche aufgrund der Interkalation der Substanz in die DNA langsamer erfolgte als die der ETO-vermittelten Strangbrüche. Durch die spezifische Ausschaltung der NHEJ-Proteine DNA PKcs und Ku70 sowie des zentralen HR-Proteins Rad51 konnte gezeigt werden, dass die NHEJ-Proteine für eine schnelle Reparatur des induzierten Schadens benötigt werden. Das zelluläre Überleben ist jedoch an Rad51 gebunden. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse wurde daher ein Reparaturmechanismus postuliert, bei dem die Doppelstrangbrüche zur schnellen Entfernung zunächst durch NHEJ ligiert werden, aufgrund von Fehlern aber anschließend durch HR überarbeitet werden müssen. Dafür spricht auch, dass die Blockade des Zellzyklus über mehrere Tage bestehen bleibt, obwohl die Entfernung der Strangbrüche wenige Stunden nach Ende der Inkubation augenscheinlich abgeschlossen ist.
Die Untersuchungen an der HT 29-Linie zeigten also, dass Rad51 Resistenz vermittelt. Durch Vergleich mit den Asciteszellen deutete sich jedoch an, dass dieser Aspekt in der klinischen Praxis von untergeordneter Bedeutung ist. Hier scheinen eher MDR und at MDR von Bedeutung zu sein. Aufgrund des kleinen Patientenkollektivs bedarf es jedoch weiterer Versuche, um diese Frage abschließend zu klären. Zudem muss getestet werden, ob die Sensitivität eines Tumors gegenüber Topo IIa-Inhibitoren durch Quantifizierung von Rad51, P gp und Topo IIa prognostiziert werden kann. Mit Hilfe eines solchen Tests wäre es möglich, Tumorzellen vor Beginn einer Therapie auf Resistenzen zu untersuchen und dem Patienten so eine erfolglose, aber mit Nebenwirkungen behaftete Behandlung ersparen zu können. In resistenten Tumoren mit hohem Rad51-Gehalt scheint zudem die Senkung des Rad51-Spiegels durch therapeutische Anwendung von Antisense-Strategien und spezifischen Inhibitoren ein viel versprechender Ansatz zu sein, das Ansprechen des Tumors zu verbessern.

Die vorliegende Arbeit hat somit gezeigt, dass molekulare Vorgänge wie DNA-Reparatur und Zellzyklusblockade, die nach der Entstehung der Doppelstrangbrüche einsetzen, die Sensitivität von soliden Tumoren gegenüber Topo IIa-Inhibitoren beeinflussen. Wie groß die klinische Bedeutung dieser Mechanismen ist, muss sich in Zukunft zeigen.
Kurzfassung auf Englisch: The present work focuses on the question whether the repair of DNA double-strand breaks has an influence on the sensitivity of solid tumours against topoisomerase IIa-inhibitors. The study was carried out in vitro using the colon carcinoma cell line HT 29 and primary cells from two patients’ ascites. The substances chosen for treatment were DOX and ETO and the exposure conditions were set according to the concentrations and times that are achieved in patients’ plasma levels.

The results confirmed the DNA strand-breaking qualities of DOX and ETO. Additionally, the substances induced cell cycle arrest during G2/M-phase, expression of Rad51, repair of strand-breaks and programmed cell death. As a result, colony formation of HT 29-cells was abrogated, with a negative correlation between the number of colonies and the amount of cells in the G2/M-phase of the cell cycle 24 hours after incubation. This indicates that the decision about the cell’s fate is being made during the first 24 hours. A slightly different reaction was observed in cells that had been incubated with a low concentration of ETO for a short time. Here, neither cell cycle arrest nor reduced colony formation were detectable, although the amount and repair of DNA damage did not differ from that of cells that had been incubated with the tenfold concentration. Based on this result, it is assumed that cell cycle arrest is being influenced by more factors than only the number of double-strand breaks.
Besides this finding, the study showed that following the incubation with DOX and ETO, DNA double-strand breaks are being rapidly repaired. Repair of DOX-induced breaks was carried out more slowly, based on its intercalation into DNA. The pathways by which DNA repair was carried out could be identified by specifically knocking down the NHEJ proteins DNA PKcs and Ku70 as well as the central protein of HR, Rad51. The data indicated that the NHEJ proteins are primarily related to repair, whereas Rad51 is more important for survival after DOX and ETO damage. Thus, a mechanism for DNA repair is postulated where error-prone NHEJ carries out the initial rejoining of DNA strand breaks while HR then checks and corrects the NHEJ-ligated breaks. This hypothesis is supported by the fact that the cell cycle is arrested for several days, although the rejoining of strand-breaks is obviously finished a few hours after removal of the topoisomerase IIa-inhibitor.
So, in HT 29-cells Rad51 was found to mediate cellular resistance to topoisomerase IIa-inhibitors. However, the comparison of HT 29 and ascites cells raised the question whether this resistance mechanism is of particular importance in clinical praxis. It rather seems that MDR and at MDR are of greater significance. To answer this question, further experiments are necessary. In addition, it ought to be tested whether the quantification of Rad51, topoisomerase IIa and P gp is a reliable predictive marker for a tumour’s sensitivity towards topoisomerase IIa-inhibitors. If so, it would be possible to test patients’ tumour cells before treatment and avoid unsuccessful therapies. Additionally, in resistant tumours expressing high amounts of Rad51, the therapeutic use of antisense strategies and specific inhibitors seems to be a promising attempt to improve sensitivity.

The present study has demonstrated that molecular actions initiated after the induction of strand-breaks, like DNA repair and cell cycle arrest, modulate the sensitivity of solid tumours towards topoisomerase IIa-inhibitors. Whether this aspect is of clinical importance has to be explored by future experiments.

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