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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-31215
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/3121/


Die Rolle von DNA-Gyrase und Efflux für die Antibiotikaempfindlichkeit, die Fitness und den DNA-Superspiralisierungsgrad eines Salmonella-Lebendimpfstammes

Preisler, Antje

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SWD-Schlagwörter: Salmonella , DNS-Gyrase , Fitness , Fluorchinolone
Freie Schlagwörter (Deutsch): Efflux , Impfstamm , DNA-Superspiralisierungsgrad
Freie Schlagwörter (Englisch): Salmonella , gyrase , efflux , supercoiling , vaccine
Basisklassifikation: 42.13 , 42.30 , 44.43 , 44.41
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.09.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 20.11.2006
Kurzfassung auf Deutsch: TAD Salmonella vacT ist ein durch Selektion auf Nalidixinsäure und Rifampicin sowie durch Behandlung mit N-Methyl-N´-Nitrosoguanidin aus dem Ausgangsstamm M415 entwickelter attenuierter Lebendimpfstamm zur Prävention von Salmonellosen bei Hühnern. Weitere Untersuchungsstämme dieser Arbeit waren Nal2ori und Nal2passage. Der Impfstamm besitzt vier genetische Marker, die phänotypisch durch Resistenz bzw. Sensibilität gegenüber bestimmten Antibiotika charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekularen Grundlagen dieser Marker untersucht. Dazu wurden alle Stämme hinsichtlich ihrer Antibiotikaempfindlichkeit, ihrer Fitness sowie bezüglich ihres DNA-Superspiralisierungsgrades analysiert. Im Vergleich der Mutanten (Nal2ori, Nal2passage) mit M415 zeigten die Ergebnisse der Empfindlichkeitsbestimmung deutlich erhöhte Nalidixinsäure- und leicht erhöhte Fluorchinolon-MHK-Werte. Der Impfstamm hingegen zeigte u.a. Rifampicin- und Nalidixinsäureresistenz sowie Makrolid- und Fluorchinolonempfindlichkeit.
Die DNA-Sequenzanalyse ergab keine Mutationen in den Genen für die Untereinheiten der Topoisomerase IV (parC, parE), die B-Untereinheit der Gyrase (gyrB) und die Sensorkinase cpxA für Nal2ori, Nal2passage und vacT im Vergleich mit M415. Allerdings wurden in vacT vier Mutationen in gyrA gefunden, dem Gen für die A-Untereinheit der Gyrase. Zwei dieser Mutationen liegen innerhalb (G75A, D87G) und zwei außerhalb (W59R, A866S) der QRDR, welche als wesentlicher Genabschnitt für die Resistenzentwicklung gegenüber Chinolonen beschrieben ist. In Nal2ori und Nal2passage konnten im gyrA-Gen nur drei Mutationen identifiziert werden. Der Aminosäureaustausch W59R tritt nur im Impfstamm vacT auf.
Nal2ori wies eine deutliche Verlängerung der Generationszeit im Vergleich zu M415 auf. Der Impfstamm zeigte gegenüber Nal2ori wieder eine kompensierte Generationszeit, wuchs aber langsamer als M415. Der DNA-Superspiralisierungsgrad betrug sowohl in Nal2ori, Nal2passage als auch in vacT 55-60 % des Ausgangsstammes. Der reduzierte Superspiralisierungsgrad und eine daraus resultierende veränderte Proteinexpression kommen als möglicher Grund für das Wachstumsdefizit in Nal2ori und für eine Virulenzreduktion in Frage. Die Ursachen für die Fitnesskompensation sind nicht bekannt. Die Wiederherstellung des Superspiralisierungsgrades durch eine intragenische Mutation konnte als Grund ausgeschlossen werden.
Weiterhin wurden über homologe Rekombinationstechniken verschiedene gyrA-Mutationen aus vacT einzeln und in Kombination in das Chromosom von M415 eingeführt. Die resultierenden isogenen Stämme wurden phänotypisch charakterisiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die in vacT auftretende gyrA-Mutation D87G (allein oder auch in Kombination mit einer der anderen Mutationen) die Gyrase so verändert ist, dass (1) die Empfindlichkeit der Gyrase gegenüber Chinolone erniedrigt ist, (2) die Aktivität des Enzyms beeinträchtigt und dadurch der Superspiralisierungsgrad reduziert ist und (3) das Auftreten der Mutation G75A keinen und das Auftreten der Mutation W59R nur einen minimalen kompensatorischen Einfluss hat. Letzterer erklärt jedoch nicht die Fluorchinolonsensibilität des Impfstammes.
Im Impfstamm kommt es zu einer Unterdrückung des durch die Mutation D87G bedingten Fluorchinolon-unempfindlichen Phänotyps. Eine intragenische Kompensation aufgrund der allein in vacT identifizierten Mutation W59R erscheint durch die Ergebnisse der Untersuchung der Rekombinanten RM415-59-87 unwahrscheinlich. Als extragenische Kompensation kommt ein reduzierter Efflux oder verstärkter Influx in Frage. Dies würde neben der Supersensibilität auf Fluorchinolone auch die erhöhten Empfindlichkeiten gegenüber z.B. Makroliden bzw. Linezolid erklären. Die Ergebnisse aus den MHK-Wert-Bestimmungen mit einem Effluxpumpeninhibitor und Messungen der Promotoraktivitäten der Effluxpumpen-Systeme AcrAB/EF-TolC geben Hinweise auf ein Defizit im aktiven Efflux. Die Kombination aus Targetgenmutationen und herabgesetzten Efflux macht die Ausprägung der MHK-Werte für den Impfstamm aus.
Als Attenuationsmarker und Ursache für die Fitnessreduktion in vacT kommen sowohl gyrA-Mutationen, rpoB-Mutation aber auch Mutationen in den Genen für die Effluxpumpen in Frage. Aufgrund der ungezielten Mutagenese während der Impfstammentwicklung können aber auch Defekte in weiteren Genen als Ursache für die Attenuation nicht ausgeschlossen werden. Die Erforschung der Zusammenhänge zwischen Superspiralisierungsgrad-abhängiger Genexpression, Fitness und Attenuation bietet interessante Ansätze für die weitere Entwicklung von Salmonella-Lebendimpfstoffen. Aber auch die Möglichkeit der Kompensation der Chinolonresistenz (hervorgerufen durch Mutationen in den Genen für die Zielstruktur Gyrase), z.B. durch das Ausschalten von Effluxpumpen, eröffnet neue Forschungsansätze bezüglich der Untersuchung von Resistenzentwicklung oder –unterdrückung.
Kurzfassung auf Englisch: Live vaccine strain TAD Salmonella vacT was derived from Salmonella Typhimurium M415 by isolating mutants which have been selected on nalidixic acid and rifampicin and also have been treated with N-Methyl-N´-Nitrosoguanidine. Strain Nal2ori is taken from a selection step during vaccine development. Nal2passage is a variant of Nal2ori. Vaccine strain TAD Salmonella vacT is used for active immunization in chicken. VacT carries four different genetic markers which are characterized by resistance or sensitivity to different antibiotics. In this study the molecular basis of these markers were analysed.
The four strains were analysed regarding their fitness, DNA supercoiling degree and susceptibility to different antibiotics. The results of the susceptibility testing of Nal2ori and Nal2passage showed increased MICs of nalidixic acid and fluoroquinolones compared to M415. Live vaccine strain vacT showed resistance to rifampicin and nalidixic acid and sensitivity to macrolides and fluoroquinolones.
DNA sequence analyses showed no mutations in the genes encoding both subunits of topoisomerase IV (parC and parE), subunit B of gyrase (gyrB) and sensor kinase cpxA comparing strains Nal2ori, Nal2passage and vacT to M415. However, in the mutants four mutations in subunit A of gyrase were found. Two of them (G75A, D87G) are located within the QRDR and two of them (W59R, A866S) are outside. The QRDR is a highly conserved region and described as the area most important for the development of fluoroquinolone resistance. In strains Nal2ori and Nal2passage only three out of the four mentioned mutations were identified. Mutation W59R was unique to vacT.
Nal2ori showed a prolonged generation time compared to M415. In Nal2passage and vacT the generation time was compensated, but the growth rate of the live vaccine strain was still reduced compared to M415. The DNA supercoiling degree of Nal2ori, Nal2passage and vacT averaged only 55-60 % to that of M415. This reduced supercoiling degree (putatively resulting in a change of protein expression) could be responsible for prolonged generation time and attenuation. The reasons for fitness compensation in Nal2passage and vacT are unknown, but restoration of the supercoiling degree can be excluded.
Using homologous recombination, different gyrA mutations - known from vacT – alone and in combination were introduced into the chromosome of M415. The resulting strains were characterized phenotypically. Recapitulatory, mutation D87G alone and also in combination with the other gyrA mutations leads to the following consequences:
(1) The susceptibility of gyrase to quinolones is reduced.
(2) The activity of the enzyme is impaired and, thus, the DNA supercoiling degree is reduced (putative reason for reduction of virulence).
(3) There is no compensatory effect (MICs, supercoiling degree) of mutation G75A and none to minimal compensatory effect of mutation W59R. The latter does not explain the hypersusceptibility to fluoroquinolones in the vaccine strain.
The normally decreased fluoroquinolone susceptibility caused by gyrA mutation D87G in the vaccine strain is obviously suppressed somehow. A plausible explanation might be an intra- or extragenic compensatory mutation. An intragenic compensation caused by mutation W59R can be excluded because of the investigations done with mutant RM415-59-87. A possible extragenic compensation is decreased efflux or increased influx resulting in increased accumulation of antibiotics. Increased accumulation could not only explain the fluoroquinolone hypersusceptibility of vacT, but also the increased susceptibilities to macrolides, ketolides and linezolide. Determination of MICs in presence of an efflux pump inhibitor as well as measurement of acrAB/EF-promoter activities indicates a deficit in active efflux of vacT. It is assumed that the MICs of vacT caused by a combined effect of target gene mutations and decreased efflux.
Mutations in gyrA, rpoB, or efflux pump genes are possible attenuation markers and responsible for fitness reduction. Due to chemical mutagenesis during vaccine strain development defects in other genes (for example in genes which play a role in fosfomycin resistance) could not be excluded as reason for attenuation. Examining the connections between supercoiling degree-dependent protein expression, fitness, attenuation as well as compensation of a fluoroquinolone resistant phenotype resulting from gyrA mutations (for example caused by reduced activity of efflux pumps) offers interesting possibilities for designing safe and stable Salmonella live vaccine strains.

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