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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-31581
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3158/


Genomics, Expression and Developmental Analysis of Murine and Human Plexin B3

Genom-, Expressions- und Entwicklungsanalyse von murinen und humanen Plexin B3

Krejcova, Sarka

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SWD-Schlagwörter: Neurogenese , Genomik , Genmutation , Genexpression , Entwicklung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Plexin B3 , Semaphorine , Entwicklung , Expressions , Sequenzvarianten
Freie Schlagwörter (Englisch): Plexin B3 , Semaphorin , Development , Expression , SNP
Basisklassifikation: 42.13 , 42.20 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Rodewald, Alexander (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2005
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 08.01.2007
Kurzfassung auf Englisch: During formation of the embryonic nervous system, axons are guided to their targets by environmental cues. Several guiding molecules have been identified, including semaphorins. Plexins are transmembrane proteins that function as receptors for semaphorins. In vertebrates, there are at least nine different plexins, grouped into subfamilies A-D according to their sequence similarity. Plexins are expressed widely, but differentially, in the developing central and peripheral nervous system. Semaphorins and their plexin receptors play important roles in patterning the connectivity of the developing nervous system, and they are involved in central and peripheral axon guidance.This work characterizes the expression and genetics of PLXNB3 the human gene of plexin B3 and PlxnB3 its mouse orthologue. PLXNB3 is located on the chromosome at Xq28. Spatial and temporal expression of PlxnB3 from stages E8–E15 of mouse embryonic development showed constant expression in the central nervous system throughout all developmental stages studied. Outside the developing nervous system, PlxnB3 was expressed in lung bud, bronchus,forelimb bud, primordial follicles of vibrissae, primordia of upper and lower teeth, thymus, and all of the epidermis. Combined ISH and immunocytochemistry performed on cultured primary cerebellar cells from six day old mice showed exclusively neuronal expression. Tissue expression profiling of human PLXNB3 was performed by Northern blot and multiple tissue RNA dot blot arrays. Northern blot detected the transcript predominantly in brain, although faint signals were also seen in colon and small intestine. ESTs analysis and allele-specific RT-PCR revealed the existence of at least four different B3-isoforms of PLXNB3 in vivo due to skipping various part of exon 27. These isoforms were differentially expressed in various tissues. The first isoform containing complete exon 27 was not detectable in heart, whereas an isoform detected in brain, heart and other tissues contains a frameshift, and an isoform lacking 82 residues encoded by exon 27 expressed exclusively in brain.
ISH on human cerebellum, hippocampus, cerebral neocortex, and thalamus revealed predominant neuronal expression. Combined ISH and immunohistochemistry revealed no expression of PLXNB3 in astrocytes or oligodendrocytes. Furthermore, using plexin B3-specific polyclonal antibodies, plexin B3 protein was detected in neurons of the central nervous system. Immunoreactivity was also observed in skin, Langerhan’s islets, myocytes, Leydig’s cells, intestine, colon, and kidney. Plexin-B3 was also detected in different human tumour tissues like astrocytoma, hepatocellular carcinoma, and colon adenocarcinoma. Since, plexins are receptors implicated in axon guidance and signal transduction, both human and mouse plexin B3 showed predominant neuronal expression and due to its location on X chromosome, PLXNB3 appeared to be a suitable candidate gene for X-linked mental retardation. Mutation screening of PLXNB3 was performed on 191 male subjects with possible or probable X-linked mental retardation. Single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) revealed six unique sequence variants, these variants most likely represent rare polymorphisms. Futhermore, the mutation screening revealed some sequence variability of PLXNB3, including ten single nucleotide polymorphisms (SNPs) and a 28 bp insertion polymorphism. Genotyping of six of these SNPs in 85 males subjects revealed 13 human haplotypes. Analysis of these haplotypes in different species, including chimpanzee, mouse, and rat sequences suggested the differentiation between ancestral and modern human haplotypes. The 1.1 kb of 5’ upstream region of PLXNB3 along with the first 1.5 kb of the transcribed region were analyzed in order to identify the region harboring the promoter. The activity of the six promoter fusion reporter constructs including various overlapping parts of the 5’ upstream region were analyzed by reporter assay. Construct p5 covering nucleotides -147 to -16 revealed the highest promoter activity in all cell lines analyzed. Construct p4, covering nucleotides -249 to -16 showed a strongly decreased promoter activity. In this construct, binding sites for three repressor elements (RE-1/NRSE neuron restrictive silencer element, GATA-1, and Delta EF1) were predicted. At the moment no human phenotype can be associated with mutations in plexin genes, but several X-linked neurodevelopmental human disorders have been mapped to Xq28. Due the localization of PLXNB3 on Xq28, the possible role of plexin B3 in neural development, and the fact that Plexin-B3 was identified as a high-affinity receptor specific for Sema5A, this gene continued to be a functional as well as a positional candidate gene for X-linked neurological disorders or mental retardation.
Kurzfassung auf Deutsch: Während der Bildung des Nervensystems werden Axone durch Leitsignale der Umgebung zu ihren Zielen geführt. Verschiedene neuronale Leitsignale wurden identifiziert, darunter die Semaphorine, eine Familie von löslichen und transmembranen Proteinen, die durch eine gemeinsame Sema-Domäne charakterisiert sind. Plexine sind große transmembrane Proteine, die als Semaphorin-Rezeptoren fungieren. Bisher untersuchte Plexine zeigen ein breites aber differenzielles Expressionsmuster im sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystem. Plexine und ihre Semaphorinliganden sind beteiligt an der zentralen
und peripheren Axonwegfindung und spielen eine wichtige Rolle bei der Vernetzung des sich entwickelnden Nervensystems. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humanes Plexin B3 (PLXNB3), und murines Plexin B3 (PlxnB3) charakterisiert. Auf mRNA-Ebene zeigen die PLXNB3 und PlxnB3 82,3% Sequenzhomologie, auf Aminosäure-Ebene 83,3%. Dieser Grad der evolutionären Konservierung deutet auf eine funktionelle Relevanz von Plexin B3 hin. Die Expression von murinem PlxnB3 wurde in den Stadien E8–E15 der Embryonalentwicklung der Maus. PlxnB3 zeigte eine konstante Expression im zentralen Nervensystem (ZNS) in allen untersuchten Stadien. Außerhalb des Nervensystems wurde PlxnB3 in den Anlagen der Lunge, der Bronchien, der Vorderextremitäten und der Zähne, sowie in Thymus und der gesamten Epidermis exprimiert. Kombinierte ISH und Immunzytochemie an kultivierten primären cerebellären Zellen sechs Tage alter Mäuse zeigten dagegen eine ausschließlich neuronale Expression. Die gewebespezifische Expression von PLXNB3 wurde mit Hilfe von Northern Blot und Multiple Tissue mRNA Arrays untersucht. Das Transkript wurde im Northern Blot vorwiegend im Gehirn detektiert; schwache Signale waren auch in Dick- und Dünndarm nachweisbar. Mit dem Multiple Tissue mRNA Array konnte eine starke Expression in verschiedenen Gehirnregionen gezeigt werden (Putamen, Medulla oblongata, Corpus Callosum, Hippocampus, cerebraler Neocortex und Cerebellum). Zusätzlich wurden schwache Signale in Milz, Thymus, Lymphknoten, Leukozyten, Nebenniere und Speicheldrüse detektiert. Mi Hilfe von ISH an humanem Cerebellum, Hippocampus, cerebralem Neocortex und Thalamus konnte ebenfalls eine vorwiegend neuronale Expression nachgewiesen werden. Kombinierte ISH und Immuncytochemie zeigten keine Expression von PLXNB3 in Astrozyten oder Oligodendrozyten. PLXNB3 wurde predominant neuronal exprimiert und konnte zusätzlich im Gefäßendothel aller analysierter Gewebe nachgewiesen werden. Weiterhin konnte Plexin B3-Protein mit Hilfe B3-spezifischer polyklonaler Antikörper in Neuronen des ZNS sowie in verschiedenen nicht neuronalen Geweben (Haut, Langerhans-Inseln, Myozyten, Leydig-Zellen, Darm und Niere) detektiert werden. Eine Expression von Plexin B3 konnte auch in verschiedenen humanen Tumorgeweben wie Astrozytom, hepatozellulärem Karzinom und Adenokarzinom des Dickdarms gezeigt werden. Plexine sind Rezeptoren, die an der Axonwegfindung und Signaltransduktion beteiligt sind. Beide Plexin B3 Orthologe zeigen eine vorwiegend neuronale Expression, was PLXNB3 zu einem Kandidatengen für mentale Retardierung macht. Es wurde ein Mutationsscreening von PLXNB3 bei 191 Patienten mit mentaler Retardierung durchgeführt. Bei diesem Mutationsscreening mit Hilfe der "single strand conformation polymorphism" (SSCP) Analyse, wurden sechs Sequenzvarianten, einschließlich dreier stiller Mutationen, zweier intronischer Veränderungen und einer missense Mutation identifiziert. Diese Varianten repräsentieren wahrscheinlich seltene Polymorphismen. Zusätzlich konnten für PLXNB3 zehn ’single nucleotid polymorphisms’ (SNPs) und ein Polymorphismus mit einer Insertion von 28 bp identifiziert werden. Basierend auf sechs dieser SNPs, wurden durch Genotypisierung von 85 gesunden Personen 13 verschiedene humane Haplotypen identifiziert. Ein phylogenetischer Stammbaum, welcher eine Differenzierung zwischen ursprünglichen und modernen humanen Haplotypen zulässt, wurde unter Einbeziehung von Schimpansen-, Maus- und Ratten-Sequenzen konstruiert. Um die region von PLXNB3 zu identifizieren, wurden 1,1 kb der 5’ flankierenden Region und 1,5 kb der transkribierten Region von PLXNB3 mit Hilfe eines Reporterassays auf ihre Promotoraktivität hin analysiert. Die Aktivität von sechs verschiedenen Konstrukten, die variierende Bereiche der 5’ flankierenden Region enthielten, wurde in CHO-K1, HEK und HeLa-Zellen untersucht. Das Konstrukt p5, welches die Nukleotide -147 bis -16 umfasste, zeigte die höchste Promotoraktivität in allen untersuchten Zelllinien. In dieser Region konnten keine bekannten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen nachgewiesen werden. Das Konstrukt p4, welches die Nukleotide –249 bis -16 (und somit auch das gesamte Konstrukt p5) einschloss, zeigte eine stark verminderte Promotoraktivität. In diesem Konstrukt wurden Bindungsstellen für drei Repressor-Elemente (RE-1, GATA-1 und Delta EF1) vorhergesagt.

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