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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-31686
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3168/


Identifikation von Stressresistenzgenen in hämatologischen Neoplasien in Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Identification of pro-survival genes in hematologic malignancies

Engelmann, Afra

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Stressresistenz , Gadd45beta , Insertionsmutagenese , Lymphom
Freie Schlagwörter (Englisch): stress resistance , Gadd45beta , insertional mutagenesis , lymphoma
Basisklassifikation: 42.13 , 42.32 , 44.81
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 08.01.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Zahlreiche Lymphome sprechen gut auf Chemo- oder Strahlentherapien an. Dies korreliert mit der Tatsache, dass die Tumore meist Wildtyp p53 exprimieren, einen der wichtigsten Mediatoren des apoptotischen Zelltods. Trotzdem führt das Auswachsen von therapieresistenten Rezidiven immer wieder zum Tod der betroffenen Patienten. Dabei ist die Resistenz nur zu einem geringen Teil auf den Verlust der Wildtyp p53 Expression zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit ist es, Hinweise auf molekulare Mechanismen zu erhalten, die das Überleben von Tumorzellen nach Induktion von Stress fördern und damit zu einer Therapieresistenz beitragen können.
Um kritische Mutationen zu definieren, die für das Überleben von Tumorzellen nach Stress verantwortlich sind, wurde die Methode der retroviralen Insertionsmutagenese erfolgreich angewendet und erweitert. Im etablierten Modell wurden durch Infektion mit dem Moloney Murine Leukemia Virus Tumore induziert und durch die Behandlung eines Teils der Tumorzellen mit gamma-Strahlung die Bedingungen einer Strahlentherapie modelliert. Es konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der Tumorzellen nach Bestrahlung durch Apoptose eliminiert wurde. Dennoch wurden stressresistente Zellen mit einer Häufigkeit von <10-4 beobachtet, die nach der Transplantation zu Sekundärtumoren auswuchsen. Die Transplantation der Tumorzellen in mehrere Rezipienten ermöglichte den Vergleich zwischen Sekundärtumoren, die aus bestrahlten und unbestrahlten Tumorzellen er-wachsen waren. Die zugrunde liegende Hypothese, dass Tumorsubklone mit einer Integrationsstelle, die durch Dysregulation eines zellulären Gens kausal für eine Stress-resistenz verantwortlich ist, durch die Bestrahlung selektioniert werden und diese Integrationsstelle in unabhängigen Experimenten mehrfach nach Bestrahlung identifiziert werden kann, wurde belegt. Mit dem neu etablierten Mausmodell wurden zahlreiche Integrationsstellen identifiziert, darunter auch bekannte common integration sites. Die Identifikation dieser Integrationsstellen in Primärtumoren sowie in bestrahlungsresistenten und –sensitiven Sekundärtumoren belegt ihre Rolle bei der Tumorgenese, argumentiert aber gegen eine Selektion durch die Bestrahlung. Eine Integration im Bcl2l1 Locus wurde in einem Tumorsatz ausschließlich nach Bestrahlung detektiert und korrelierte mit einer verstärkten Expression des Gens Bcl2l1, welches für das anti-apoptotische Protein Bcl-xL codiert. Durch Überexpression des Proteins konnte belegt werden, dass Bcl-xL nach Bestrahlung die Apoptose verhindert. Damit wurde bewiesen, dass das etablierte System zur Identifikation von Stressresistenzgenen geeignet ist. Ein weiterer Integrationsort, der in mehreren Sekundärtumoren nach Bestrahlung identifiziert wurde, war der Gadd45beta Locus. Analysen der stressresistenten Tumore mit dieser Integration zeigten erhöhte Gadd45beta Expression und deuteten auf eine Rolle von Gadd45beta bei der Ausbildung einer Stressresistenz hin. Es konnte gezeigt werden, dass Gadd45beta ein Onkogen ist, da Fibroblasten, die das Protein überexprimierten, in der Lage waren, Tumore in vivo zu bilden. Zwar konnte Gadd45beta die Apoptose nach Bestrahlung nicht verhindern, dennoch war das Protein in der Lage, den Zelltod nach Serumentzug zu inhibieren. Damit konnte gezeigt werden, dass das Protein durch Inhibition des nicht-apoptotischen Zelltods zu einer Stressresistenz von Tumorzellen beitragen kann.
Kurzfassung auf Englisch: In many hematologic malignancies the p53 tumor suppressor protein, a key regulator of apoptosis, is intact and thus the diseases respond well to classical radio- or chemotherapies. However, despite the initial good response, long-term survival rates are often poor due to the outgrowth of therapy resistant clones and subsequent relapse of the disease. Although inactivation of the p53 protein is an obvious mechanism for resistance, this is rarely the case. The goal of this work was to define the molecular mechanisms by which hematopoietic malignant cells escape stress and thus contribute to therapy resistance.
In order to define critical mutations which are responsible for the survival of tumor cells after induction of genotoxic stress, we have successfully applied and extended the method of retroviral insertional mutagenesis. In our mouse model, tumors were induced by Moloney Murine Leukemia Virus infection. Radiation therapy was modelled by treating tumor cells with gamma irradiation. This treatment triggered apoptosis in the tumor cells, but cells that escaped apoptosis were detected in transplanted animals at an incidence of <10-4. Viral integration sites in independent tumor sets, comparing treated to non-treated tumors, were isolated. We were able to prove our hypothesis that tumor subclones with an integration that is – by deregulating cellular gene expression - causally responsible for stress resistance were selected for by irradiation and were found in numerous independent experiments. A number of loci were identified that were shared by both radiation resistant and sensitive tumors and genes in those loci were previously shown to play a role in tumorigenesis. However, we also identified two loci, at which integration correlated with the acquisition of radiation resistance. One mapped to the Bcl2l1 locus and an integration correlated with overexpression of the Bcl2l gene, which codes for the important anti-apoptotic protein Bcl-xL. This provided a satisfying proof-of-principle to our approach. The second integration mapped to the Gadd45beta locus. Analysis of stress resistant tumors comprising this integration showed elevated Gadd45beta expression and hint for a role of Gadd45beta in therapy resistance. We were able to identify Gadd45beta as a novel oncogene, since overexpressing fibroblasts formed tumors in vivo. Interestingly and different to other known “classical” anti-apoptotic factors, high Gadd45beta levels did not protect against UV or gamma-irradiation induced apoptosis, but conferred a strong and specific survival advantage against serum withdrawal. This confirmed the hypothesis that also inhibition of non-apoptotic cell death can lead to stress resistance of tumor cells.

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