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Titel: Einfluss der N-Glykosylierung und des C-Terminus auf die Protein-Proteinwechselwirkungen der rTas1r-Familie der Süßgeschmacksrezeptoren
Sprache: Deutsch
Autor*in: Walter, Bettina
Schlagwörter: G Protein gekoppelte Rezeptoren; Heterodimerisierung
GND-Schlagwörter: Protein-Protein-WechselwirkungGND
GlykosylierungGND
Lokalisation
süß
Geschmack
Endoplasmatisches Retikulum
Erscheinungsdatum: 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 2007-02-02
Zusammenfassung: 
Die Geschmackswahrnehmung wird durch definierte Signaltransduktionswege – Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) – von Geschmackszellen, die sich in Geschmacksknospen auf der Zunge und dem Gaumen befinden, vermittelt. Die Tas1R-Rezeptorfamilie, aus deren Untereinheiten die Süß- und umami-Rezeptoren gebildet werden, besitzt drei Mitglieder, Tas1R1, Tas1R2 und Tas1R3. Sie gehören zur Subgruppe C der GPCRs, zu denen z. B. auch die metabotropen Glutamatrezeptoren zählen. Auffallend bei den Rezeptoren der rTas1r-Familie ist die lange N-terminale Domäne, die auch als „Venus-Fliegenfallen-Modul“ bezeichnet wird und über die die Ligandenbindung erfolgt, sowie seine kurze C-terminale Domäne, die wichtig für die Signaltransduktion ist.
Vorarbeiten haben gezeigt, dass Süßgeschmacksrezeptoruntereinheiten und ihre N-terminalen Domänen als sekretorische Proteine exprimiert werden können, aber nicht effektiv entlang des sekretorischen Weges transportiert werden. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der N-Glykosylierung und der C-terminalen Domäne auf die Dimerisierung, die Lokalisierung und die Funktionalität des Süßgeschmacksrezeptors zu untersuchen. Beide Rezeptoren rTas1r2 und rTas1r3 besitzen jeweils neun potentielle N-Glykosylierungspositionen, die durch gerichtete Mutagenese von N zu Q mutiert worden sind. Durch Endoglykosidasen-Behandlung konnte gezeigt werden, dass rTas1r3 und seine Mutanten mit mannosereichen Zuckerketten modifiziert worden sind. Dies zeigt ihren unvollständigen Transport aus dem ER in den Golgi-Komplex, welches für die Wildtyprezeptoren durch Ko-Immunpräzipitation (Ko-IPs) mit den ER-Markern Calnexin, Calreticulin und BiP/GRP78 bestätigt werden konnte. Die Fähigkeit der Mutanten zur Dimerisierung wurde durch Ko-IPs überprüft. Es zeigten sich drei Mutanten (rTas1r2N531Q, rTas1r3N85Q und rTas1r3N130Q) die jeweils nicht mehr mit dem Wildtyprezeptor dimerisierten. Die beiden Mutanten rTas1r2N531Q, rTas1r3N85Q können aufgrund fehlender Stabilität keine funktionellen Dimere mehr bilden, während die Dimerisierung der dritten Rezeptormutante rTas1r3N130Q aufgrund der Lage der Glykosylierungsstelle in der Nähe einer intermolekularen Disulfidbrücke am C 129 möglicherweise verhindert wird. Die Funktion der mutierten Rezeptoren wurde durch fluorimetrische intrazelluläre Ca2+-Bestimmung im FLIPR (in Kollaboration mit dem Labor v. Prof. W. Meyerhof, DIfE) untersucht. Nach Transfektion in HEK293-Zellen, die stabil G(alpha)16gust44 exprimieren, zeigten die Rezeptormutanten, die nicht mehr dimerisierten, nach Gabe des Süßliganden Steviosid ein reduziertes Ca2+-Signal. Besonders stark war die Reduktion des Ca2+-Signals der Mutante rTas1r3N130Q. Eine zusätzlich eingeführte N-Glykosylierungsstelle an der Position N 58 zeigte keine Beinflussung der Dimerisierung jedoch eine Reduktion des Ca2+-Signals im FLIPR. Rezeptoren, die an der C-terminalen Domäne deletiert wurden, zeigen weiterhin ihre Fähigkeit zur Dimerisierung, so dass daraus geschlossen werden kann, dass sich die Domäne für eine Dimerisierung nicht im Bereich der C-terminalen Domäne der Rezeptoren befindet. Experimente zu ihren funktionellen Eigenschaften zeigen ein deutlich reduziertes Ca2+-Signal, so dass zu vermuten ist, dass die G-Protein Bindung in diesem Bereich des Rezeptors erfolgt und durch die Deletion der C-terminalen Domäne behindert wird.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Proteininteraktion von rFhl-2, einem Mitglied der FHL-Familie, mit der C-terminalen Domäne von rTas1r1, rTas1r2 und rTas1r3 zunächst im Hefe-System näher untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die halbe und die erste LIM-Domäne für eine Interaktion ausreichend sind und die Interaktion mit dem rTas1r1-ct stärker ist. Keine Interaktion konnte mit der C-terminalen Domäne von rTas1r3 nachgewiesen werden. Die Expression von rFhl-2 in sensorischen und nicht-sensorischen Geweben konnte mittels RT-PCR gezeigt werden. Der Nachweis einer Interaktion in einem heterologen Zellkultursystem konnte weder mit der C-terminalen Domäne von rTas1r1, -2 und -3 noch mit einer den Süßgeschmacksrezeptor stabil exprimierenden Zell-Linie erbracht werden.

The perception of taste is mediated by defined transduction pathways involving ion channels and G-protein-coupled membrane receptors (GPCRs) of taste cells located in taste buds on the tongue and the palate. The Tas1R family of sweet and umami receptors consists of three subunits, Tas1R1, Tas1R2 and Tas1R3. These receptors belong to the subfamily C of the GPCRs along with e.g. metabotropic glutamate receptors and feature an extended N-terminal binding site, the “Venus-Fly-Trap-Module” and a relatively short intracellular domain for signal transduction.
Previous results of our group and others have shown, that sweet taste receptors and their N-terminal domains expressed as secretory proteins are inefficiently transported through the intracellular compartments towards the sites of plasma membrane insertion or secretion, respectively. The N-terminal domains of the sweet taste receptors exhibit several consensus sites of glycosylation. Both receptors rTas1r2 and rTas1r3 have nine potential glycosylation sites and to this end, we began to exchange the amino acid residues of the glycosylation sites in the rTas1r2 and rTas1r3 from N to Q by site directed mutagenesis. Our results suggest that all the glycosylation sites were used. In general the glycosylation was Endo H sensitive pointing to an incomplete transport of the receptor from the ER to Golgi compartments. These results were confirmed by Co-IP analysis with the ER marker proteins calnexin, calreticulin und Bip/Grp78. The ability of the receptor mutants to form dimers was tested with Co-IPs. The results had shown that the mutants rTas1r2N531Q, rTas1r3N85Q and rTas1r3N130Q could not dimerize as a result of loss of the receptor stability for the mutants rTas1r2N531Q, rTas1r3N85Q and of the location of the N-glycosylation site near an intermolecular disulfide-bridge at the position C 129 for the mutant rTas1r3N130Q. Further we tested the function of the mutated receptors in a fluorimetric intracellular Ca2+-assay, using the FLIPR (in collaboration with the Meyerhof lab, DIfE). HEK293 cells stably expressing G(alpha)16gust44 were transfected with combinations of the wildtype and the mutated receptors. The combinations, which lost their ability to dimerize, gave a reduced signal compared with the wildtype receptors when we used steviosid as a sweet ligand. A receptor mutant with an extra N-glycosylation site at the position N 58 showed normal dimerization but a reduction of the Ca2+ signal in the functional assay. In an other experimental approach to test the influence of the C-terminus of the sweet taste receptor, we prepared a truncated version of both receptors. In Co-IPs together with the wildtype we could show that the C-terminus had no influence on the dimerization. In the Ca2+-assay these pairs showed a reduction because probably the G protein could not bind at the correct site.
In the second part of the work the interaction of the C-terminal domains of rTas1r1 and rTas1r2 with rFhl-2, a member of the four and a half LIM family was tested. Initially the interaction was checked in the yeast-two-hybrid system. It coud be shown that the half and the first LIM domain are essential for the interaction with rTas1r1-ct, rTas1r2-ct and rTas1r3-ct and that the interaction between rFhl-2 and rTas1r1-ct was stronger. No interaction was detectable between rTas1r3 and rFhl-2. In the next step using RT-PCR the expression of rFhl-2 in sensory and other tissues was demonstrated. For further investigations a cell culture based system was used to verify these interaction. In heterologous cells the interaction with r Fhl-2 could nether be demonstrated for the tagged C-termini of rTas1r1, -2 and -3 nor for the entire receptor stably expressed in a cell line.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/1657
URN: urn:nbn:de:gbv:18-32265
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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