Untersuchungen zur Rolle des Transkriptionsfaktors C/EBPalpha bei der normalen und aberranten Hämatopoese mit Hilfe der RNA-Interferenz Methode

Abstract

Die vorliegende Doktorarbeit hatte zum Ziel, einen Beitrag zu liefern, die Bedeutung des Transkriptionsfaktors C/EBPa sowohl für die normale Hämatopoese wie auch für die Entstehung der akuten myeloischen Leukämie (AML) besser zu verstehen. Das CEBPA-Gen ist in circa 25% aller AML-Patienten mutiert oder runterreguliert. Um zu verstehen, welche Bedeutung eine reduzierte Expression von CEBPA für die humane Myelopoese hat, wurde die Expression des CEBPA-Gens mit Hilfe der RNA-Interferenz (RNAi) –Methode teilweise ausgeschaltet und der Effekt auf die Differenzierung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen des Menschen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die RNAi-Methode für CEBPA und zum Vergleich für TEL, das ebenfalls für einen Transkriptionsfaktor kodiert, etabliert. Verschiedene kurze RNA-Stücke (siRNA) wurden mit Hilfe des Vektors pSUPER bzw. retroviraler Vektoren mit einer SUPER-Kassette exprimiert. Die Effektivität der jeweiligen siRNAs wurde in Zelllinien getestet, die CEBPA bzw. TEL transient oder stabil in Form von bizistronischen mRNAs exprimieren, die zusätzlich für ein Fluoreszenzprotein kodieren. Die RNAi-vermittelte Reduktion der Expression von CEBPA bzw. TEL konnte daher als Veränderung der Fluoreszenz mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden. Auf diese Weise wurden zwei siRNAs, die die Expression von CEBPA deutlich reduzieren, identifiziert und für die weiteren Versuche eingesetzt. Ein Vergleich verschiedener retroviraler Vektoren hinsichtlich der Expression von siRNA zeigte, dass die sog. SIN-Vektoren, bei denen die Enhancerregion in der LTR deletiert ist, besonders gut für diese Zwecke geeignet sind. Dieser Befund ist von großem praktischem Interesse für alle RNAi-Experimente, bei denen retrovirale Vektoren benutzt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, welchen Effekt eine reduzierte CEBPA-Expression auf die Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen hat. Zu diesem Zweck wurde in CD34+-Zellen mit Hilfe des oben genannten retroviralen Vektors siRNA exprimiert, die die Expression von CEBPA erniedrigt. Die infizierten und sortierten CD34+-Zellen wurden in Flüssigkulturen sowie im semisoliden Medium (CFU-C Assay) zur Differenzierung gebracht. Es zeigte sich, dass ein reduzierter Level an C/EBPa zu einem Differenzierungsblock in der myeloiden Abstammungsreihe führt, der gekennzeichnet ist durch eine verringerte Anzahl von reifen Granulozyten und dem Auftreten von unreifen, maligne aussehenden Zellen. Dieser Befund macht deutlich, wie wichtig dieser Transkriptionsfaktor für die myeloide Differenzierung beim Menschen ist. Auffallend war weiterhin, dass nach Runterregulation von CEBPA das Verhältnis von myeloiden zu erythroiden Zellen erniedrigt war. Anhand der absoluten Kolonienzahl im CFU-C Assay konnte gezeigt werden, dass die Ursache hierfür nicht ein verringertes Kommitment für die myeloide Differenzierung sondern eine verringerte Proliferation der für die myeloide Differenzierung bereits festgelegten Zellen war. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eine Reduktion der CEBPA Expression zu einem Differenzierungsblock führt, der dem bei AML entspricht. Allerdings haben die differenzierungsblockierten Zellen nur eine begrenzte Proliferationskapazität. Daher sind für die Entstehung einer reifen AML weitere Ereignisse erforderlich.