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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-33211
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3321/


Biochemische Charakterisierung von LmxMPK1, einer essentiellen MAP Kinase aus Leishmania mexicana

Melzer, Inga Maria

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Leishmania , Kinase , Parasiten , Signaltransduktion
Freie Schlagwörter (Englisch): signalling , kinase , MAP , mitogen , Leishmania
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fleischer, Bernhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.03.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 06.06.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Leishmanien sind parasitische Protozoen, die für ein breites Spektrum an Erkrankungen des Menschen verantwortlich sind. Krankheitsbilder reichen von der selbstheilenden cutanen Leishmaniose bis zu generalisierten, viszeralen Infektionen, die unbehandelt einen tödlichen Verlauf nehmen können. Leishmanien besitzen einen digenetischen Lebenszyklus. In den Überträgerinsekten, den Sandmücken, liegen sie als begeißelte Promastigoten im Verdauungstrakt vor, die dann im Blut des Säugerwirts von Makrophagen aufgenommen werden. In den Phagolysosomen differenzieren sie zu den kleineren, unbegeißelten Amastigoten. Mit 12 Millionen Betroffenen und bis zu 2 Millionen Neuinfektionen im Jahr stellt die Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Gebieten aber auch im Mittelmeerraum vorkommt, ein wichtiges Gesundheitsproblem dar. Bei einer Vielzahl zellulärer Prozesse konnte bis zum heutigen Tag eine Beteiligung von in Signalkaskaden eingebundenen Proteinkinasen nachgewiesen werden. Auch in den Trypanosomatiden liegen bereits konkrete Hinweise vor, dass Proteinkinasen wichtige Rollen z.B. bei Proliferation und Differenzierung spielen. Aufgrund der signifikanten Unterschiede zwischen Leishmanien-Kinasen und ihren Äquivalenten in höheren Eukaryoten, stellen diese wertvolle Zielstrukturen für neue Therapien der Leishmaniose dar. Ziel dieser Arbeit war die biochemische Charakterisierung der Leishmania mexicana MAP Kinase LmxMPK1, für die bereits 1998 eine essentielle Rolle bei der Proliferation des amastigoten Lebensstadiums gezeigt werden konnte. Darüber hinaus sollte versucht werden, diese Kinase durch Identifikation von Aktivatoren und Substraten in eine Signaltransduktionskaskade einzuordnen.Zunächst konnte gezeigt werden, dass LmxMPK1 auch bei der Proliferation des promastigoten Stadiums eine Rolle spielt, da eine Deletionsmutante deutlich langsamer proliferierte als Wildtyp-Parasiten. Eine Untersuchung der in vitro-Aktivität des rekombinanten Enzyms zeigte, dass LmxMPK1 auch ohne vorherige Aktivierung bereits basale Auto- und Substratphosphorylierungsaktivität gegenüber artifiziellen Substraten wie MBP besitzt. Die Kinase weist dabei eine Präferenz von Mn2+- gegenüber Mg2+-Ionen auf und zeigt eine optimale Aktivität bei pH 7,5 und Temperaturen um 37°C. Die Autophosphorylierung der Kinase ist eine intramolekulare Reaktion und findet an dem Tyrosinrest des TXY-Aktivierungsmotivs in der Phosphorylierungslippe statt, einem Motiv in dem bei MAP Kinasen höherer Eukaryoten sowohl der Threonin- als auch der Tyrosinrest phosphoryliert sein müssen, um maximale Aktivität zu erzielen. Ich konnte hingegen zeigen, dass bei LmxMPK1 in vivo ausschließlich eine Phosphorylierung des Threoninrestes stattfindet, der essentiell für die Funktionalität des Enzyms ist. Außerdem kann die Kinase durch Austausch des Threonins gegen die negativ geladene Aminosäure Glutamat in vivo aktiviert werden. Alle bisher in L. mexicana bekannten MAPKK Homologe sowie drei neu identifizierte und im Rahmen dieser Arbeit untersuchte MAPKK Homologe wurden ohne Erfolg auf ihre Fähigkeit, LmxMPK1 zu aktivieren, getestet. Auch zwei Zellzyklus-regulierende Kinasen, CRK3 und Polo-Kinase, zeigten keine Aktivierung von LmxMPK1. Bei verschiedenen Versuchen, Substrate von LmxMPK1 zu finden, konnten zwei mögliche Substratproteine identifiziert werden. Der Transkriptionsinitiationsfaktor TFII D ist in allen Organismen hochkonserviert und spielt eine Rolle bei der Initiation der RNA-Polymerase II-Transkription. Bei dem zweiten Protein handelt es sich um ein unbekanntes, hypothetisches Protein, das wie z.B. viele Transkriptionsfaktoren eine Zinkfingerdomäne besitzt und ausschließlich in den Trypanosomatiden vorkommt. Beide Proteine wurden in vitro schwach von LmxMPK1 phosphoryliert. Da diese aber nicht aktiviert war, konnte so keine abschließende Aussage getroffen werden, ob es sich in vivo tatsächlich um Substrate der Kinase handelt.
Durch Mutation eines Phenylalaninrestes in der katalytischen Tasche von LmxMPK1 zu Glycin konnte eine inhibitorsensitive Mutante generiert werden. Diese Kinase zeigte in vitro Substrat- und Autophosphorylierungsaktivität,die sich im Gegensatz zu der Wildtyp-Kinase durch Einsatz dreier spezifischer Inhibitoren in hohen Konzentrationen hemmen ließ. Die inhibitorsensitive Mutante wurde außerdem episomal in eine LmxMPK1-Deletionsmutante eingebracht und zeigte sich in der Lage, den Phänotyp der Deletionsmutante zu komplementieren. In vivo-Experimente mit Inhibitoren und rekombinanten Leishmanien zeigten erfolgreich die Funktionalität des Systems in Promastigoten sowie axenischen Amastigoten. Dabei konnten auch in Promastigoten starke Auswirkungen des „Ausschaltens“ der Aktivität von LmxMPK1 beobachtet werden. Damit konnte ein System etabliert werden, welches es ermöglicht,die Aktivität einer bestimmten Kinase in vivo gezielt auszuschalten, um z.B. die Auswirkungen auf den Phosphorylierungsstatus der zellulären Proteine zu untersuchen.
Kurzfassung auf Englisch: Protozoan parasites of the genus Leishmania cause a broad range of human diseases ranging from self-healing cutane lesions to visceral infections which, if untreated, are fatal. Leishmania have a digenetic life cycle. In their insect vector, the phlebotomine sandfly, they live extracellularly in the midgut as flagellated promastigotes. Following infection, they are taken up by macrophages in the mammalian blood where they differentiate into smaller, non-flagellated amastigotes in the phagolysosomes. With 12 million people infected and up to 2 million new cases each year, Leishmaniasis, which is found mainly in tropical and subtropical areas but also in the Mediterranian, is a major health problem worldwide. Protein kinases, integrated in diverse signalling cascades, have been proven to play major roles in a multitude of cellular processes. In the trypanosomatids, different protein kinases have already been shown to play important roles in differentiation and proliferation of the different life stages. Because of the significant differences between some Leishmania kinases and their equivalents in higher eucaryotes, these enzymes are valuable targets for medical treatment. Leishmania mitogen activated protein (MAP) kinase cascades which have already been examined to some extent in Leishmania mexicana are especially well-suited for drug development. The aim of the present study was the biochemical characterization of LmxMPK1, which was shown in 1998 to be essential for proliferation of the amastigote life stage. Additionally,putative activators were tested for their potential to activate this MAP kinase and various attempts to identify substrates of this enzyme were undertaken.First,it could be shown that LmxMPK1 is also involved in proliferation of the promastigote life stage of the parasite, as a LmxMPK1 deletion mutant showed slower proliferation than the wild type parasites.It was shown that, even without prior activation, LmxMPK1 already possesses basal auto- and substrate phosphorylation activity in vitro. The enzyme shows a preference for Mn2+- over Mg2+-ions and has an optimal activity at pH7.5 and temperatures of around 37°C. Autophosphorylation is an intramolecular reaction and takes place at tyrosine 178 of the TDY motif of the phosphorylation lip. In MAP kinases of higher eucaryotes, both the threonine and the tyrosine residue have to be phosphorylated to generate maximum activity. In LmxMPK1, however, only the threonine residue, which is essential for LmxMPK1 activity, is phosphorylated in vivo. Additionally, the kinase can be activated in vivo by replacement of the threonine residue with a negatively charged residue like glutamate which substitutes for the phosphorylated threonine. Every MAPKK homologue already known in L. mexicana as well as three newly identified MAPKKs, which have been isolated and subcloned during this study, were tested for their potential to activate LmxMPK1, albeit without success. Furthermore, two cell cycle-regulating kinases, CRK3 and polo-like kinase were also not able to activate LmxMPK1. Using different methods for kinase substrate identification, two potential in vitro-substrates were identified and examined. The transcription initiation factor TFII D is highly conserved throughout all organisms and plays a major role in RNA-polymerase II dependent initiation of transcription. The second potential substrate is a hypothetical protein which, just as many transcription factors, possesses a B-box zinc finger domain and is highly conserved throughout the trypanosomatids with no close homologues in other species. Both proteins were weakly phosphorylated in vitro by LmxMPK1. However, as LmxMPK1 was not available in an activated state, it still remains to be verified if the two proteins are substrates of LmxMPK1 in vivo.An inhibitor-sensitized mutant of LmxMPK1 was generated by mutating a phenylalanine residue in the catalytic pocket of LmxMPK1 to glycine. In spite of the mutation, this kinase shows auto- and substrate phosphorylation activity in vitro which could be inhibited by high concentrations of three specific inhibitors. The activity of the wild type enzyme was not affected by the compounds. Additionally, this mutant was expressed episomally in Leishmania mexicana in a LmxMPK1 deletion background and was shown to restore the non-proliferating phenotype of the deletion mutant. In in vivo experiments with inhibitors and recombinant parasites the functionality of this system could be shown in both pro- as well as axenic amastigotes. In the course of these experiments, strong effects on proliferation and morphology of the parasites could also be observed in the promastigote life stage.Hence, a system could be established which allows to shut down the activity of a specific Leishmania kinase in vivo to study the impact on the phosphorylation status of the cellular proteins.

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