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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-33516
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3351/


Molekulargenetische Analyse positioneller und funktioneller Kandidatengene bei Patienten mit Zimmermann-Laband-Syndrom

Moleculargenetic Analysis of Positional and Functional Candidate Genes in Patients with Zimmermann-Laband Syndrome

Abo-Dalo, Benjamin

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SWD-Schlagwörter: Kandidatengen , Chromosomenaberrat , SNP , Translokation , Genexpres , Erbkrankheit , Polymerase-Kettenreakt , Punktmutation , DNS-Sequenz , DNS
Freie Schlagwörter (Deutsch): Zimmermann-Laband-Syndrom , Brachydaktylie Typ B , Gingivafibromatose , Anonychie , Onychodystrophie
Freie Schlagwörter (Englisch): Zimmermann-Laband syndrome , brachydactyly type b , gingival fibromatosis , anonychia
Basisklassifikation: 42.13 , 44.48 , 42.20
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Gal, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.04.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 02.07.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Das Zimmermann-Laband-Syndrom (ZLS) ist eine seltene, autosomal-dominant vererbte Erkrankung, die primär durch Gingivafibromatose, verdickte orale Schleimhäute und Schwellung der perioralen Weichgewebe charakterisiert ist, sowie durch Skelettauffälligkeiten wie Hypoplasie/Dysplasie der terminalen Phalangen und Anonychie oder Onychodystrophie. Zwei cytogenetisch balanciert erscheinende Translokationen, eine 3;8- und eine 3;17-Translokation, bei Patienten mit ZLS gaben Hinweise auf eine Kandidatenregion, da die Bruchpunkte auf den beiden derivativen Chromosomen 3 in der Region p14.3 ~280 Kb auseinander liegen. Die durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eingegrenzten Bruchpunkte der 3;8-Translokation konnten durch die PCR-Amplifikation so genannter Verbindungsfragmente auf molekularer Ebene charakterisiert werden.
Durch den Bruch in 3p14.3 der 3;8-Translokation wurde kein Gen direkt unterbrochen, so dass die dazu distal und proximal kartierenden Gene als positionelle Kandidaten für das ZLS angesehen wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden DNA- und auch einige RNA-Proben von 21 Patienten mit ZLS bzw. einem dazu ähnlichen Phänotyp und unauffälligem Karyotyp einer umfassenden molekulargenetischen Analyse unterzogen, mit dem Ziel, mit dem ZLS assoziierte, genetische Defekte zu identifizieren. Das in der 3p14.3 Region befindliche WNT5A-Gen ist ein besonders vielversprechender Kandidat, da das Genprodukt an für die Skelettentwicklung wichtigen Signalwegen beteiligt ist. Zudem weisen Wnt5a-defiziente Mäuse verschiedene skelettale und faziale Veränderungen auf, die bemerkenswerte Ähnlichkeiten zu den klinischen Merkmalen von Patienten mit ZLS zeigen. Durch eine Mutationsanalyse der Kodierregionen von 10 Genen aus der Region 3p21.1-p14.3, einschließlich WNT5A, konnten insgesamt 83 Sequenzvarianten identifiziert werden. 23 dieser Mutationen waren nicht in den Datenbanken als „single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) bekannt, konnten jedoch durch den Nachweis bei einem gesunden Elternteil der Patienten und/oder Kontrollpersonen als nicht-pathogene Sequenzvarianten identifiziert werden. Durch verschiedene Techniken wie FISH und die Analyse von SNPs wurden keine Hinweise auf das Vorliegen von submikroskopischen Deletionen im Bereich des WNT5A-Gens sowie in dazu benachbarten Regionen bei Patienten mit ZLS erhalten. Um zu untersuchen, ob dem ZLS möglicherweise Mutationen in den Kodierregionen von Genen, deren Genprodukte am WNT5A-abhängigen Signalweg beteiligt sind, zugrunde liegen, wurden ROR2, FZD2, FZD5, FZD7 und DKK1-4, die für WNT5A-Rezeptoren bzw. die WNT-abhängige Signalkaskade modulierende Proteine kodieren, einer Mutationsanalyse unterzogen. Von den insgesamt 23 detektierten Sequenzvarianten war keine nachweislich mit dem ZLS assoziiert.
Um zu untersuchen, ob eine aberrante Expression von einem oder mehreren Gen/en in 3p14.3 möglicherweise mit der Erkrankung assoziiert ist, wurden Analysen mit Hilfe der semiquantitativen und quantitativen „real-time“-RT-PCR an RNA aus lymphoblastoiden Zellen einiger Patienten mit ZLS durchgeführt. Es zeigten sich relativ homogene Expressionswerte für die Gene C3orf63 und CCDC66 bei Patienten und Kontrollpersonen. Im Gegensatz dazu fanden sich unterschiedlich starke Expressionsprofile für die Gene WNT5A und ARHGEF3 sowie der nicht in 3p kartierenden Gene ROR2 und WNT10B in den untersuchten Zelllinien der Patienten und Kontrollpersonen. Eine Validierung dieser Ergebnisse erfolgte durch die Bestimmung der Expression verschiedener "housekeeping genes", die sehr homogene Expressionswerte ergaben. Eine Assoziation der Expressionslevel eines bestimmten Gens mit dem ZLS konnte nicht gezeigt werden.
Für eine korrekte zeitliche und örtliche Expression werden für bestimmte Gene so genannte „long-range regulatory elements“, die bis zu 1 Mb von einem Gen entfernt lokalisiert sein können, benötigt. Diese cis-regulatorischen Elemente können durch nicht-kodierende, konservierte DNA-Sequenzelemente (CNGs) in der genomischen DNA repräsentiert werden. Durch DNA-DNA-Sequenzvergleiche von verschiedenen Spezies wurden CNGs in der Region 3p21.1-p14.3 identifiziert und neun für eine Mutationsanalyse bei Patienten mit ZLS ausgewählt. Eine Assoziation der in diesen CNGs detektierten Sequenzvarianten mit dem ZLS konnte nicht festgestellt werden.
Abschließend lässt sich festhalten, dass die in dieser Arbeit durchgeführte extensive molekulargenetische Analyse der Region 3p21.1-p14.3 bisher nicht zum Auffinden des genetischen Defektes beim ZLS geführt hat. Dennoch gelang es, eine Reihe von in der Literatur noch nicht beschriebenen genetischen Veränderungen in einzelnen Genen bzw. DNA-Sequenzelementen in dieser genomischen Region zu identifizieren, welche allerdings nicht mit dem ZLS assoziiert sind.
Kurzfassung auf Englisch: Zimmermann-Laband syndrome (ZLS) is a rare disorder characterized by coarse facial appearance including bulbous nose, thickened lips, thick and floppy ears, gingival hypertrophy, aplasia or dysplasia of hand- and toenails as well as the terminal phalanges, and hyperextensibility of joints. Autosomal dominant inheritance has been suggested, however, the genetic basis of ZLS is unknown. Two apparently balanced translocations in patients with ZLS, a familial 3;8 translocation in both mother and daughter and a 3;17 translocation in a male patient, were investigated. Delineation of both chromosome 3 breakpoints revealed that the CACNA2D3 gene in 3p14.3 was disrupted by one breakpoint whereas the other one mapped 100 kb downstream of CACNA2D3, strongly suggesting that the ZLS gene is located in this region. Subsequent mutation analysis of CACNA2D3 in 20 patients with ZLS or overlaping phenotypes did not reveal any pathogenic mutation. As it can not yet be exclude that both breakpoints cause a position effect by disrupting the disease gene from cis-acting regulatory elements, another 9 genes (CHDH, IL17RB, ACTR8, SELK, LRTM1, WNT5A, ERC2, CCDC66, and C3orf63) surrounding both breakpoints were also analysed for pathogenic mutations in these patients.
Wnt5a is expressed at the digit tips of mice. It is known that genes involved in early development show a tightly regulated temporal and spatial expression which is controlled by regulatory elements located far away from the gene. Therefore mutation analysis was also performed for 9 highly conserved non-genic sequences (CNGs), which were identified by inter species comparative sequence analysis, and that are located up to 1 Mb distal from the 3’ end of WNT5A.
To elucidate whether altered expression of genes located in the 3p21.1-p14.3 breakpointregion is causative for ZLS, real-time PCR analysis was performed for seven ZLS patients for whom a lymphoblastoid cell line was available. Disease associated expressionlevels could not be detected.
Since pathogenic mutations in the region 3p21.1-p14.3 as basis of ZLS in individuals without chromosomal rearrangement could not be proven, the underlying genetic defect still has to be discovered.

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