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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-33684
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3368/


Tissue Engineering von humanen Hepatozytensphäroiden auf biologisch abbaubaren PLLA-Matrices in pulsatiler Flusskultur zur Transplantation

Melbeck, Stefan

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SWD-Schlagwörter: Tissue Engineering , Leber
Freie Schlagwörter (Deutsch): human , Flusskultur , Hepatozyten
Freie Schlagwörter (Englisch): Tissue Engineering , human , hepatocyte , liver , flow culture
Basisklassifikation: 42.15 , 44.65
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pollok, Jörg-Matthias (PD Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.06.2007
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 23.07.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Einleitung:
Hintergrund dieser Arbeit ist die Suche nach Alternativen zur Lebertransplantation. Die Lebertransplantation stellt bis heute die ultimative Therapie bei akutem und chronisch fortgeschrittenem Leberversagen dar. Trotz Verbesserungen der Operationstechniken, des Verteilungsverfahrens von Spenderorganen, der Einführung der Leberlebendspende
und der Split-Leber-Transplantation, besteht bei nur leicht ansteigender Zahl der Organspenden und überdeutlich ansteigender Zahl neuangemeldeter Patienten zur
Lebertransplantation ein Mangel an Spenderorganen. Ein Weg, dem Organmangel zu begegnen, könnte der Ansatz der Leberzelltransplantation sein. Ein Hauptproblem ist der große Zellverlust nach Transplantation. Ein Ansatz ist die mit Mitteln des Tissue Engineering Vorkultivierung von Hepatozyten auf biokompatiblen, abbaubaren Polymeren mit Bildung von sphäroidalen Hepatozytenaggregationen, die sich in Versuchen mit Rattenleberzellen als vorteilhaft bezüglich der Überlebensrate, Syntheserate und Widerstandsfähigkeit gegenüber Einzelzell- oder Monolayerkulturen gezeigt haben.
Gegenstand dieser Arbeit war es, ein dreidimensionales Fluss-Kulturmodell für die in vitro Kultur von humanen Hepatozyten, die auf PLLA-Matrices ausgesiedelt wurden, auf die Bildung von sphäroidalen Aggregationen zu prüfen und deren Funktionalität durch Messung der Stoffwechselleistung und Erfassung deren anatomischen Eigenschaften zu erfassen. Dieses Flusskulturmodell wurde bereits mit Rattenhepatozyten in Vorversuchen in Hinblick auf die Ausbildung von Sphäroiden und dem Nachweis von
hepatozytenspezifischen Funktionsleistungen erfolgreich getestet.
Methoden:
Isolierte Hepatozyten von nicht transplantierten Spenderorganen, Resektaten größenreduzierter Spenderorgane und Operationsresektaten wurden auf PLLA-Polymer-
Matrices ausgesiedelt und in Flusskultur gebracht. Alle zwei Tage erfolgte die Entnahme eines Systems und ein Mediumwechsel. Die Polymere wurden
phasenkontrastmikroskopisch auf Sphäroidbildung untersucht. Die Sphäroide wurden ausgezählt und vermessen. Die Zellen auf den Polymeren wurden auf den DNA-Gehalt und auf den mRNA-Gehalt für Albumin untersucht. Im Kulturmedium wurden die Syntheseprodukte Albumin, a-1-Antitrypsin und Harnstoff quantitativ bestimmt. Histologisch wurden die Sphäroide mit der HE-Färbung aufbereitet und immunhistochemisch die Antigene Albumin, a-1-Antitrypsin, Cytokeratin 18, Vimentin und PCNA dargestellt. Elektronenmikroskopisch wurde die Morphologie der Sphäroide sowie deren zellulärer Aufbau dargestellt.
Ergebnis:
Es wurden 16 Versuche der Isolation von humanen Hepatozyten unternommen. Die Isolationsergebnisse reichten von einer Zahl isolierter vitaler Zellen von weniger als 100000 Zellen bis 9,9 x 10 12 Zellen mit einer mittleren Vitalität von 74%. Von 10 Isolationen wurden Hepatozyten kultiviert, von denen in 6 Kulturen die Bildung von sphäroidalen Aggregationen ab dem 4. bis zum 12. Tag zu beobachten war. Die Sphäroide hatten durchschnittliche Durchmesser von 140 bis 160 Mikrometer. Eine signifikante Tendenz zur Größenzunahme zeigte sich nicht. Das Maximum der Sphäroidanzahl war
durchschnittlich am 6. Kulturtag erreicht. Die SPH-Gruppe war der N-SPH-Gruppe in Albumin- und Harnstoffsyntheserate deutlich überlegen. Es wurde analog zur Albumin- und
Harnstoffsynthese die a-1-Antitrypsin-Synthese bis zum 12. Tag in Kultur nachgewiesen. Die DNA-Messung war ohne statistisch signifikantes Ergebnis. In der histologischen und elektronenmikroskopischen Aufarbeitung der Sphäroide zeigte sich die leberzelltypische Organisation bis zum sechsten Tage abgeschlossen. Der Nachweis von Albumin, a-1-
Antitrypsin und Cytokeratin 18 bestätigte, dass Hepatozyten den allergrößten Anteil der Sphäroiden ausmachten. Eine geringe Beteiligung nicht-epithelialer Zellen konnte durch
Detektion von Vimentin dargestellt werden.
Diskussion:
Die Ausbildung von sphäroidalen Aggregationen von humanen Hepatozyten in Flusskultur auf dreidimensionalen PLLA-Polymer-Matrices ist prinzipiell möglich. Die Fähigkeit zur Bildung von Sphäroiden scheint ein Indikator für die Vitalität und Funktionalität der Hepatozyten zu sein, denn sie zeigen stabile Syntheseraten. Die Vielzahl der Variablen
bezüglich anatomischer Bezugsquelle, Zellqualität und Polymerbeschaffenheit müssten noch weiter definiert werden, um gezielter zum Erfolg einer Vorkultivierung mit
Sphäroidbildung zu gelangen. Sphäroide sind Einzelzellsuspensionen überlegen und deren Einsatz im Bereich der durch Tissue Engineering unterstützten Zelltransplantation sollten zur Entwicklung von Alternativen zur Organtransplantation weiter verfolgt werden.
In der Vereinigung von den Vorteilen der sphäroidalen Organisation und der Kultur auf abbaubaren Polymermatrices zur Verbesserung der Transplantationseffizienz liegt ein
möglicher Weg, dem Mangel an Spenderorganen durch vorkultivierte Leberzelltransplantation in Zukunft zu begegnen.
Kurzfassung auf Englisch: Introduction:
Background of this research is the searching for alternative methods for liver transplantion. Liver transplantation is up to now the ultimative therapy for acute and chronic liver failiure. Despite progresses in the operation techniques, procedures of delivery of donor organs, the introduction of living-related liver donation and split-liver-transplantation there is a lack of organ donations. One posibility to prevent the lack of organs could be the liver cell transplantation. One main problem is the great loss of cells after transplantation. A promising method could be the pre-culture of human hepatocytes with the methods of Tissue Engineering on biocompatible, biodegradable polymers with culturing spheroidal hepatocyte-aggregations, which showed advantage in experiments with rat hepatocytes in rate of survival, rate of synthesis and resistance to single-cell- or monolayer-cultures.
Subject of this research was to investigate a three-dimensional flow-culture-model for in vitro culture of human hepatocytes seeded on PLLA-matrices to observe the formation of spheroids and investigate the functionality through measering of metabolism and anatomical qualities. In previous experiments this flow-culture-model has shown the formation of shperoids and hepatocyte specific function with rat hepatocytes.
Methods:
Isolated human hepatocytes of not transplantated donor organs, sice-reduced donor organs and resections at liver operations have been seeded on PLLA-polymer-matrices and been put into flow-culture. Partial medium exchange happended every second day and one culture system was investigated. The investigation of the polymers was done under phasecontrastmicroscope to observe the aggregation of spheroids, where they have been counted and measured. The DNA-concentration and the mRNA for albumine on the polymers has been measured.The concentration of albumine, alpha-1-antitrypsine and urea in the culture-medium have been measured. Immunehistochemical staining of albumine, alpha-1-antitrypsine, cytoceratine 18, vimentine and PCNA have been done. Cellular morphology was demonstrated by electronemiroscopy.
Results:
16 examinations of isolation of human hepatocytes have been done. 100000 to 9,9 x 10 12 vital cells were harvested with an avarage vitality of 74%. Of 10 Isolations the hepatocytes have been cultivated. In 6 out of 10 cultures the aggregation of spheroids at the 4th to 12th day in culture could be observed. The avarage diameter was 140 to 160 micrometres. No progress in the diameter could be shown. The maximum number of spheroids was at the 6th day in culture. The SPH-group was superior to the N-SPH-group in the synthesis rate of albumine and urea. Same as albumine the synthesis of alpha-1-antitrypsine and urea up to the 12th day of culture could be shown. The measing of DNA showed no statistically significant result. The electronemicroscope investigation showed hepatocyte-typical organisation. The main number of cells into the spheroids showed the antigens of albumine, alpha-1-antitrypsine and cytoceratine 18 as a character of hepatocytes. A little number of non-epithelial cells could be proved by vimentine-staining.
Discussion:
The spheroidal aggregation of human hepatocytes in flow-culture on three-dimensional PLLA-polymers is generally possible. The ability of spheroid formation seems to be an indicator for the vitality and functionaltiy of hepatocytes, because they show stable rates of synthesis. A high amount of variables of anatomical properties, cellqualities and polymer-properties must be defined, to get more specific results in cultering shperoids. Spheroids are superior to single-cell-suspensions. Their application in the field of cell transplantaion supported by Tissue Engineering should be the interest of further investigations in the development of alternative methods to organ transplantation. In the combination of advatages of spheroidal formation and the culture on biodegradble polymer-matrices is a possible way to face the lack of donor organs.

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