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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-33939
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3393/


Nachweis von drei neuen Mutationen im Ryanodinrezeptorgen (RYR1) bei Patienten mit Maligner Hyperthermie und Human Stress Syndrom

Detection of three novel mutations in the ryanodin receptor gen in patients with malignant hyperthermia and human stress syndrom

Krieger , Thorsten

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Narkosezwischenfall , Hitzschlag , Anesthesiezwischenfall , Sarkoplasmatisches Retikulum , Hypermetabolismus
Freie Schlagwörter (Englisch): Malignant hyperthermia , exercise induced rhabdomyolysis , human stress syndrom , mutation , ryanodinreceptor
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Singh, Surjit (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 06.08.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Zusammenfassung

Im dieser Arbeit wurden zehn Maligne Hyperthermie (MH) Patienten und acht Humane Stress Syndrom (HSS) Patienten, die in denen in vitro Kontrakturtest (IVCT) pathologische Werte zeigten, genetisch untersucht. Hierzu wurde von den 18 Patienten und von 25 nichtverwandten Kontrollpersonen genomische DNA isoliert und 12 ausgewählte Exons des Ryanodinrezeptorgens mittels PCR amplifiziert. In der SSCP-Elektophorese konnten neben der schon in anderen MH-Patienten nachgewiesene Mutation C1840T (Arg614Cys) drei weitere, bisher unbekannte C1077T(Ala359Ala), A1453G(Met485Val), und A6556G (Met2196Val) detektiert und mittels Sequenzieung identifiziert werden.
Außerdem wurden, um keine Mutation zu übersehen und die Sensitivität der SSCP-Eleptrophorese zu überprüfen, auch alle übrigen PCR Produkte der 12 Exons sequenziert. Hierbei konnten zwei weitere Mutationen, G1668A(Ser556Ser) und G6385A(Asp2129Asn) nachgewiesen werden. Die stille Mutation G1668A(Ser556Ser) erwies sich, da auch in Kontrollpersonen nachzuweisen, als Polymorphismus. Die zweite stille Mutation C1077T (Ala359Ala) fand sich hingegen in sechs Patienten, nicht jedoch in den Kontrollpersonen. Denkbar ist hier ein unterschiedliches Splicing der mRNA, das zur Prädisposition der MH führen könnte. Ferner konnte gezeigt werden, dass in der NCBI-Gendatenbank eine fehlerhafte Sequenz des Introns 14 vorliegt.
Für drei in dieser Arbeit gefundenen Mutationen und einen Polymorphismus konnte eine Restriktiosschnittanalyse zur schnellen Detektion der Basensubstitution etabliert werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die ausgesprochene Heterogenität der MH, die in den bisherigen Untersuchungen festgestellt wurde. Die Tatsache, dass auch in den HSS-Patienten Mutationen im Ryanodinrezeptor nachgewiesen werden konnten untermauert die Vermutung, dass es eine enge Verwandtschaft beider Syndrome gibt. Der invasive IVCT bleibt aufgrund der Heterogenität der „goldene Standard“ und kann zur Zeit noch nicht durch molekulargenetische Diagnostik abgelöst werden.
Kurzfassung auf Englisch: Summary
In this molecular genetic study a cohort of 10 patients with maliginant hyperthermia (MH) and 8 patients with human stress syndrome (HSS), which all tested as pathological MHS type by in vitro contraction test (IVCT), were studied for the presence of mutations in the ryanodin receptor gene RYR1. Also three male siblings of the MH patients, who were assigned a MHE phenotype by IVCT, were also to be included in the study if a mutation was identified in the corresponding sib index patient. Genomic DNA was isolated from peripheral blood of the above mentioned 18 patients, three siblings and 25 normal healthy control subjects and 12 selected exons of the RYR1 gene were amplified by PCR. Using the first approach of SSCP followed by direct sequencing of the abnormal samples, two hitherto unknown mutations c.1453A>G (p.Met485Val), and c.6556A>G (p.Met2186Val) along with two already known mutations c1840C>T (p.Arg614Cys) and c.1077C>T (p.Ala3539Ala) were identified. In order not to oversee any mutation and to check the sensitivity of the SSCP, all the PCR products of the tested exons were subjected to an examination by direct sequencing. This lead to further identification of two additional mutations, c.1668G>A (p.Ser556Ser) and c.6385G>A (p.Asp2129Asn). The silent mutations c.1077C>T and c.1668G>A turned out to be polymorphisms because of their presence also among the normal controls. In addition, during the course of the present study a discrepancy in the sequence of the intron14 as reported in the NCBI genebank could be identified and corrected. Furthermore three of the identified mutations and a polymorphism of this study were verified by an alternative method of the DNA fragment analysis after restriction enzyme digestion and standardised for a screening test.
The results of this study, which revealed three novel mutations in RYR1 gene, further emphasizes the observed large molecular heterogeneity among the MH patients. The finding of mutations in RYR1 gene also in patients with HSS would point to a close relationship of the two syndromes. Due to this observed large heterogeneity, the invasive IVCT still remains a “golden standard” for the preclinical testing and cannot at present be replaced by a molecular genetic test.

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