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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-34056
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3405/


Expression und Isolierung von Domaenen der dsRNA abhaengigen Proteinkinase (PKR) fuer die Aufklaerung der Tertiaerstruktur mittels NMR-Spektroskopie

Expression and isolation of the dsRNA dependent proteinkinase (PKR) for NMR structure studies

Debus, Mirjam A.

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Basisklassifikation: 44.81 , 44.33
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Erguen, Sueleyman (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.06.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 20.08.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Bei dem vorliegenden Projekt geht es um die Modulation der Translation als möglicher Ansatz in der antineoplastischen Therapie. Im Fokus steht hier die von doppelsträngiger Virus-RNA (dsRNA) aktivierte Proteinkinase (PKR), welche einen inhibitorischen Effekt auf die Translation ausübt.

Bei der Proteinbiosynthese ist die Initiation der Translation besonders strikt reguliert. Durch Inhibition der Translationsinitiation werden bevorzugt G1-Cycline supprimiert, was zu einem Zellzyklusstillstand in der G1-Phase führt. Substanzen, die modulierend auf dieser Ebene eingreifen, versprechen antiproliferativ, aber nur gering toxisch zu wirken. Die PKR stellt somit ein potenzielles Zielmolekül in der antiproliferativen Therapie dar. Zudem spielt PKR eine Schüsselrolle in der antiviralen Abwehr. Induziert durch Interferon-alpha und aktiviert durch dsRNA vermittelt PKR die Herabregulierung viraler Replikation in infizierten Zellen.

Maligne Tumore weisen in der Regel eine gesteigerte translationelle Aktivität, insbesondere eine gesteigerte Expression von Proto-Onkogenen auf. Die Möglichkeit einer präferentiellen Herabregulierung von wachstumsfördernden Proteinen auf Ebene der Translationsinitiation beruht auf der Tatsache, dass Proteine verschiedene messenger Ribonukleinsäuren (mRNA) Spezies besitzen, die in ihrer translationalen Effizienz hundertfach variieren. Die meisten der bekannten Proto-Onkogene und Wachstumsfaktoren haben komplexe mRNA Strukturen, die eine starke translationelle Regulation vermuten lassen. Sie zeigen beispielsweise hochkomplexe 5’Untranslated Regions (5’UTRs), welche die Rekrutierung der ribosomalen Untereinheiten erschweren, und dadurch eine stärkere Abhängigkeit von unterstützenden Faktoren erforderlich machen. Es ist also davon auszugehen, dass Proto-Onkogen-mRNAs im besonderen Maße von Initiationsfaktoren der Translation abhängig sind.

Ziel dieses Projektes war es, einen Beitrag zu Strukturanalysen einzelner Domänen mittels nukleärer Magnetresonanzspektroskopie (NMR) zu leisten. Bisher konnte eine für die NMR geeignete Isolierung des Proteins aus unterschiedlichen Expressionssystemen nicht gelingen, da es zum einen zu groß für die NMR-Analytik ist, zum anderen erschwerte eine geringe Löslichkeit die Isolierung. Bei dem vorliegenden Projekt wurden Konstrukte generiert, die sowohl die individuellen Domänen, als auch das gesamte C-terminale Segment enthalten. Um die Löslichkeit zu erhöhen, wurden unterschiedliche Fusionsproteine gebildet. Die Isolierung der Fusionsproteine gelang mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Die NMR-Analyse der Kinasedomäne wurde mittels TROSY-15N-heteronukleärer singulärer Quantum-Koherenz (HSQC) Experimente durchgeführt. Auf diese Weise konnten erstmals mittels NMR dreidimensionale Strukturelemente der Kinasedomäne von PKR charakterisiert, und deren mit den regulativen Domänen interagierenden Regionen lokalisiert werden. Die generierten Informationen erlauben nun eine exaktere Untersuchung der Aktionsmechanismen von PKR und bieten zudem die Basis für die Entwicklung von kleinen aktivierenden Molekülen zum Zweck einer mehr spezifischen weniger toxischen antineoplastischen sowie antiviralen Therapie.

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