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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-34246
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3424/


Entwicklung und Charakterisierung eines neuen in vitro-Herzmuskelmodells aus embryonalen Stammzellen

Generation and characterisation of a new embryonic stem cell-derived in vitro-heart muscle-model

Rogge, Christina

Originalveröffentlichung: (2007) Zimmermann WH, Didie M, Doker S, Melnychenko I, Naito H, Rogge C, Tiburcy M, Eschenhagen T. (2006) Heart muscle engineering: An update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 2006 Aug 1;71(3):419-29
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SWD-Schlagwörter: Herzfunktion , Deutschland / Stammzellgesetz
Freie Schlagwörter (Deutsch): humane und murine embryonale Stammzellen , Herzmuskelmodell , künstliches Herzgewebe , in vitro-Modell
Freie Schlagwörter (Englisch): embryonic stem cells , heart tissue
Basisklassifikation: 44.35 , 44.38 , 44.85
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.09.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 17.09.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Künstliche Herzmuskelgewebe (Engineered Heart Tissue; EHT) eignen sich prinzipiell als in vitro-Modell zur Testung von herzwirksamen Substanzen, zur Identifikation neuer Therapieziele (Target-Validierung) oder auch zur Gewebeersatztherapie in vivo. Bisher wurden EHTs lediglich aus Kardiomyozyten embryonaler Hühnchen, neonataler Ratten und neonataler Mäuse hergestellt. Primäre Herzmuskelzellkulturen sind schlecht standardisierbar und können aus menschlichem Herzgewebe nur schwer etabliert werden. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) können in undifferenzierter Form unbegrenzt vermehrt und prinzipiell in alle Zelltypen, inklusive Herzmuskelzellen, differenziert werden. ES-Zellen sind im Mausmodell gut etabliert. Menschliche ES-Zellen stehen seit Kurzem ebenfalls zur Verfügung und zeigen ein vergleichbares Differenzierungs- und Wachstumspotential. Ziel dieser Arbeit war es daher, zunächst die prinzipielle Anwendbarkeit von murinen ES-Zellen zur Herstellung von EHTs zu überprüfen. Folgeuntersuchungen sollten sich dann auf die Entwicklung eines humanen ES-Zell-Modells fokussieren.

Zunächst wurden im Rahmen dieser Dissertationsarbeit murine und humane embryonale Stammzellkulturen im Institut für Pharmakologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf etabliert. Zur Gewinnung aufgereinigter Herzmuskelzellpopulationen aus murinen ES-Zellen wurde ein bereits etabliertes transgenes Verfahren verwendet. Dafür wurde eine Antibiotikaresistenz (Neomycin) unter Kontrolle eines Herzmuskelzell-spezifischen Promotors stabil in ES-Zellen eingebracht. Zusätzlich wurde ein neues transgenes Modell entwickelt, dass neben der Neomycinresistenz ebenfalls Herzmuskelzell-spezifisch ein grün-fluoreszierendes Protein (GFP) sowie eine kernlokalisierte beta-Galaktosidase (nLacZ) exprimiert. Zur Herstellung humaner EHTs wurden transgen GFP-exprimierende ES-Zellen (hES3-ENVY) verwendet. Murine ES-Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Differenzierung oder auch undifferenziert für die EHT-Herstellung eingesetzt. Humane EHTs wurden ausschließlich aus vordifferenzierten Embryoidkörpern hergestellt. Grundsätzlich wurden EHTs aus ES-Zellen (undifferenziert und vordifferenziert), Kollagen Typ I, Matrigel und serumhaltigem Kulturmedium generiert. Nach einer 3-tägigen Kondensierungsphase, gefolgt von einer Konditionierungsphase unter mechanischer Dehnung (murine EHTs: 28 Tage Kultur, davon 8 Tage ohne und 20 Tage mit G418-Selektion, humane EHTs: 7-21 Tage) wurden isometrische Kontraktionsmessungen, Kontraktionsfrequenzanalysen sowie umfangreiche morphologische Untersuchungen mittels Lichtmikroskopie, konfokaler Laserscanning Mikroskopie und Elektronenmikroskopie durchgeführt. Schließlich wurde im humanen EHT-Modell auch die in vivo-Anwendung als Gewebeimplantatmaterial überprüft.

Es wurden 17 stabil transformierte murine ES-Zelllinien (herzmuskelspezifisch exprimierte Neomycinresistenz; Identifikation mittels Southern Blotting, funktionelle Charakterisierung durch herzmuskelspezifische Antibiotikaselektion) und 8 murine ES-Zelllinien mit stabiler Integration des im Rahmen dieser Arbeit klonierten multicistronischen Indikatorplasmids (Identifikation mittels Southern Blotting, funktionelle Charakterisierung durch herzmuskelspezifische Antibiotikaselektion, GFP- und LacZ-Signal) generiert. EHTs aus undifferenzierten selektionierbaren murinen und vordifferenzierten humanen ES-Zellen entwickelten spontane synchrone Kontraktionen, zeigten maximale Kontraktionskräfte von ~0,5 mN sowie einen positiv inotropen Effekt auf Calcium und Isoprenalin. Humane ES-Zell-EHTs zeigten zusätzlich einen positiv lusitropen Effekt von Isoprenalin sowie einen positiv chronotropen Effekt von Isoprenalin und 3-Isobutyl-1-methylxanthin. Eine Kultur der murinen ES-Zell-EHTs über 6 Monate führte zu keiner Einschränkung der Kontraktionskraft. Histologische Untersuchungen zeigten, dass sich die Zellen sowohl innerhalb als auch an der Oberfläche der EHTs verteilen. Kardiomyozyten in EHTs zeigten einen relativ hohen Differenzierungsgrad (charakteristische Querstreifung bei alpha-Aktinin-Färbung; Z-, I-, A-, H- und M-Banden in elektronenmikroskopischen Untersuchungen). Dabei war das Ausmaß der Differenzierung von der Integration der Herzmuskelzellen in komplexen Muskelbündeln (hoher Differenzierungsgrad) abhängig. Einzeln in EHTs liegende Herzmuskelzellen zeigten dagegen in der Regel ein weniger reifes Entwicklungsmuster. Abschließend wurden humane EHTs in immunsupprimierte Ratten implantiert. Dabei zeigte sich, dass humane ES-Zell-EHTs mindestens 3 Wochen in vivo überleben und ihre Muskelstruktur erhalten.

Aus ES-Zellen der Maus und des Menschen können EHTs generiert werden. Trotz einiger Anzeichen kardialer Unreife zeigen diese wichtige funktionelle und morphologische Eigenschaften von nativem Myokard. ES-Zell-EHTs sind möglicherweise als in vitro-Modell und langfristig zum kardialen Gewebeersatz in vivo geeignet.
Kurzfassung auf Englisch: Artificial cardiac tissue (Engineered Heart Tissue; EHT) can principally be used
both as an in vitro model for substance screening, development of new therapies (target
validation) and for replacement therapy in vivo. EHTs have been generated from
cardiomyocytes of embryonic chicken, neonatal rats and mice. Primary heart muscle cell
cultures can hardly be standardized and are difficult to establish from human heart.
Undifferentiated embryonic stem cells (ES-cells) can be propagated unlimitedly and
differentiate in all kind of cell types, including cardiomyocytes. Mouse ES-cells are well
established. Recently human ES-cells became available and show a comparable differentiation and proliferation potential. The aim of this study was to evaluate whether mouse ES-cells can be used to generate EHTs and, in a second step, to transfer these experiences to human EScells.

During this dissertation mouse and human ES-cell cultures have been established
in the Institute of Pharmacology at the University Hospital Hamburg-Eppendorf. A transgenic
strategy was used to yield pure cardiomyocyte populations from mice ES-cells. For this
purpose an antibiotica resistance (neomycin) was inserted in ES-cells under the control of a heart muscle-specific promoter. Additionally a new plasmid was constructed, which in addition to the resistance to neomycin, a green-fluorescent protein (GFP) as well as beta-galactosidase (nLacZ) with a nuclear localizated signal are driven by a heart muscle-specific promotor to visualize differentiating cardiac myocytes. For human EHT generation GFP-expressing ES-cells (hES3-ENVY) were used. Mouse ES-cells were used in various states of differentiation or undifferentiated for the EHT production. Human EHTs were exclusively produced from pre-differentiated embryoid bodies. Basically EHTs were generated from ES-cells or their derivatives, collagen type 1, Matrigel and serum-containing culture medium in circular casting molds. After condensation for three days the EHTs were transferred to a static stretching device and cultured for 28 days (murine EHTs; 8 days without and 20 days with neomycin-analogon G418) or 7-21 days (human EHTs). Force of contraction and spontaneous beating rate were measured under physiological conditions (37 °C, Tyrode´s solution) in thermostatted organ baths. Tissue and cell development were determined on
fixed specimens by light, confocal laserscanning and electron microscopy. A first series of human EHTs was transplanted on hearts of immune-suppressed rats to evaluate survival, development and potential teratoma formation in vivo.

17 stable transgenic murine ES-cell lines were identified by southern blotting and
cardiomyocyte-specific resistance to G418. 8 murine ES-cell lines were established, stably
integrating the multicistronic plasmid which was identified by southern blotting. These lines
exhibited a cardiac myocyte-specific antibiotic resistance to G418 as well as a specific GFP and LacZ-signal. EHTs from undifferentiated selectable mouse and pre-differentiated human
ES-cells developed spontaneous synchronous contractions and showed maximum contractile forces of ~0.5 mN as well as a positive inotropic effect on calcium and isoprenaline. Human ES-cell-EHTs also showed a positive lusitropic response to isoprenaline and 3-isobutyl-1-methylxanthin. Cultivation of mouse EHTs for 6 months did not reduce force of contraction. Cells were distributed both at the EHT surface and within the EHTs. Cardiomyocytes in the EHTs showed characteristic cross striation by alpha-actinin staining and Z-, I-, A-, H- and some of them M-bands in electron microscopy, indicating relatively high differentiation. The degree of differentiation depended on the integration of the cardiomyocytes in complex muscle bundles (high differentiation status) in contrast to single cardiomyocytes. Human EHTs implanted on rat hearts showed GFP and actinin-positive cells with cross striation, indicating 3 weeks survival in vivo and maintenance of muscle structures.

EHTs can be generated from murine and human ES-cells. Despite evidence of
cardiac immaturity these EHTs show important functional and morphological properties of native myocardium. ES-cell-EHTs might be useful as an in vitro model and, in the long-run, for cardiac replacement therapy in vivo.

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