Funktionelle Interaktion des Kv4.2-Proteins mit akzessorischen Untereinheiten — Rolle für die somatodendritische A-Typ-Kaliumkanal-Expression in hippokampalen Neuronen von Maus (Mus musculus, Linné,1758) und Ratte (Rattus norvegicus, Berkenhout,1769)

Abstract

Kv4.2-Kaliumkanäle sind spannungsgesteuert und zeigen eine schnelle Inaktivierung. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der dendritischen Erregung. Mit den Kaliumkanal-interagierenden Proteinen (KChIPs) und den Dipeptidylaminopeptidaseähnlichen Proteinen (DPPs) wurden zwei wichtige Gruppen von akzessorischen beta-Untereinheiten beschrieben, die in heterologen Expressionssystemen in der Lage sind, die elektrophysiologischen Eigenschaften und die funktionelle Oberflächenexpression der Kv4.2-alpha-Untereinheit nachhaltig zu beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle dieser akzessorischen Untereinheiten für die subzelluläre Lokalisation und die funktionelle Oberflächenexpression der Kv4.2-alpha-Untereinheit in hippokampalen Neuronen untersucht. Zusätzlich zu einem auf RNA-Interferenz basierenden experimentellen System wurden Punktmutationen in die Kv4.2-alpha-Untereinheit eingeführt, die die Interaktion mit den akzessorischen beta-Untereinheiten verhindern sollten. Weiterhin wurden die Kanaluntereinheiten mit Varianten des Fluoreszenzmarkers EGFP fusioniert und mit Epitopen versehen, die einen einfachen immunzytochemischen Nachweis der Oberflächenexpression ermöglichten. Mit den in den N-Terminus eingebrachten Punktmutationen konnte ein vollständiger Verlust der KChIP2-Interaktion erzielt werden, der in elektrophysiologischen Experimenten und Koimmunpräzipitationen dokumentiert wurde. In kultivierten hippokampalen Neuronen erwies sich die funktionelle Interaktion mit KChIP2 weder für den Transport des Kv4.2-Kanals in die Dendriten noch für dessen Oberflächenexpression als essentiell. Allerdings konnte eine verstärkte Oberflächenexpression des Kv4.2-Wildtyp-Kanals in Gegenwart von KChIP2 gezeigt werden, die bei einer KChIP2-bindungsdefizienten Kv4.2-Variante nicht erreicht wurde. Punktmutationen, für die in der Literatur ein Bindungsverlust von DPPY an die Kv4.3-alpha-Untereinheit beschrieben wurde, zeigten in Kv4.2 keinen Einfluss auf die Wechselwirkung mit DPPX. Daher legen die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente unterschiedliche strukturelle Determinanten für die Wechselwirkung von Kv4.3 und DPPY einerseits bzw. Kv4.2 und DPPX andererseits nahe. Interessanterweise konnte für die akzessorische DPPX-Untereinheit ein Kv4.2-abhängiger Transport an die Oberfläche der Neuronen gezeigt werden.

Kv4.2 potassium channels are voltage-gated and show a fast inactivation. They play an important role in the regulation of dendritic excitability. There are two important groups of accessory subunits that are able to modulate the electrophysiological properties and the functional surface expression of Kv4.2-alpha-subunits in heterologous expression systems. These accessory proteins are the K+ channel interacting proteins (KChIPs) and the dipeptidylaminopeptidase-like proteins (DPPs). The role of these accessory subunits for the subcellular localization and functional surface expression of the Kv4.2-alpha-subunit in hippocampal neurons was investigated in this work. A knock-down approach and modified Kv4.2-alpha-subunits, deficient for binding accessory subunits, were used in parallel to interfere with the interaction of accessory subunits. Moreover, channel-subunits have been tagged with epitopes, allowing easy visualization of localization and functional surface expression. Point mutations, introduced into the N-terminus of the Kv4.2-alpha-subunit, lead to a total loss of KChIP2-interaction as shown in electrophyiological recordings and coimmunoprecipitations. The functional interaction of KChIP2 with the Kv4.2 channel was not essential in neurons, with respect to both the transport of the Kv4.2 channel into the dendrites and its surface expression. However, surface expression of Kv4.2 wildtype channels was increased in the presence of KChIP2, a feature which was not found in a KChIP2-binding-deficient Kv4.2 channel. Point mutations in the Kv4.3-alpha-subunit for which interference with DPPY-interaction has been reported did not show any effect on the interaction with DPPX when introduced in the Kv4.2-alpha-subunit. The experiments done in this work imply different structural determinants for the interaction of Kv4.3 and DPPY or Kv4.2 and DPPX, respectively. Interestingly, the accessory DPPX-subunit appeared in a Kv4.2-dependent manner at the neuronal surface.