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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-34497
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3449/


Identifizierung neuer Interaktionspartner der Kinase MARKK aus Rattus norvegicus

Johne, Cindy

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Zellskelett , Mikrotubulus , Actin , Signaltransduktion , Alzheimer-Krankheit
Freie Schlagwörter (Englisch): Cytoskeleton , Microtubule organization , Actin organization,
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.03.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 16.10.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die Serin/Threonin-Kinase MARKK gehört zur Familie der Ste20 Kinasen und ist in verschiedenen Signaltransduktionswegen involviert. Neben einer Funktion in der p38/MAPK Signaltransduktionskaskade konnte eine Beteiligung an der Regulation der Tau-Phosphorylierung nachgewiesen werden. Hierbei aktiviert MARKK die vier Mitglieder der MARK-Familie (MARK1-4), welche wiederum MAPs wie z.B. das neuronale Tau direkt phosphorylieren können (Timm et al. 2003, Drewes et al. 1995). Der Phosphorylierungsstatus von Tau reguliert dessen Fähigkeit, an Mikrotubuli zu binden und beeinflusst auf diesem Wege die Mikrotubuli-Stabilität. Kommt es zu einem verstärkten Ablösen des phosphorylierten Tau-Proteins von den Mikrotubuli, kann dies zur pathologischen Aggregation von Tau in intrazelluläre neurofibrilläre Bündel führen, wie man sie bei der Alzheimer Krankheit findet. Somit ist eine strikte Kontrolle der einzelnen Komponenten des MARKK – MARK – MAP(Tau) Signaltransduktionsweges unerlässlich.

Da über die Regulation der MARKK bislang wenig bekannt war, sollten im ersten Teil dieser Arbeit neue Interaktionspartner mit Hilfe eines Hefe Zwei-Hybrid Screens identifiziert werden. Neben weiteren Proteinen wurde auf diesem Wege eine Wechselwirkung zwischen MARKK und Spred1 ermittelt. Spred1 gehört zu einer Familie von Membran-assoziierten Regulatorproteinen, welche die durch Wachstumsfaktoren induzierte Aktivierung der ERK-Signaltransduktionskaskade unterdrücken (Wakioka et al. 2001). Die Charakterisierung der Interaktion ergab, dass MARKK und Spred1 zwar aneinander binden, doch dass die Interaktion keinen Einfluss auf die Aktivität der MARKK hat.

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Aktin-regulierenden Kinase TESK1. Es ist bekannt, dass diese den Aktin-depolymerisierenden Faktor Cofilin inaktiviert und auf diese Weise die Ausbildung von stabilen Stressfasern in der Zelle fördert (Toshima et al. 2001a). Wie aus Daten über sprouty4, einem Spred1-verwandten Protein, vermutet wurde, konnte eine Wechselwirkung zwischen TESK1 und dem MARKK-Interaktionspartner Spred1 ermittelt werden (Tsumura et al. 2004). Eine direkte Bindung konnte nicht nur in Hefe Zwei-Hybrid Tests und in einem GST-Pulldown Bindungsassay nachgewiesen werden, sondern auch durch Kolokalisationsstudien in einem Modell-Zellsystem (CHO Zellen). Vor allem die Daten aus den Koexpressionsstudien deuten auf eine hemmende Wirkung von Spred1 auf die Kinase TESK1 hin. Spred1 kann also über diese neu charakterisierte Interaktion Einfluss auf die Aktin-Stabilität nehmen. Somit stellt die Spred1 – TESK1 Wechselwirkung eine neue Schnittstelle zwischen dem zentralen ERK-Signalübertragungsweg (Differenzierung, Proliferation) und der Organisation des Aktin-Netzwerkes dar.

Aus den Ergebnissen der beiden ersten Abschnitte leitete sich eine Arbeitshypothese ab, bei der der gemeinsame Interaktionspartner Spred1 als Brückenprotein (scaffold) eine Verbindung zwischen der Mikrotubuli-regulierenden Kinase MARKK und der Aktin-regulierenden Kinase TESK1 schafft. Überraschender Weise konnte auch eine direkte Interaktion zwischen MARKK und TESK1 festgestellt werden. Mittels in vitro Aktivitäts-Assays und Überexpressionstudien in verschiedenen Zellsystemen wurde die funktionelle Relevanz dieser neu identifizierten Wechselwirkung belegt. Hierbei zeigte sich, das TESK1 die Kinaseaktivität der MARKK inhibieren kann, während MARKK nicht in der Lage ist, einen Einfluss auf TESK1 auszuüben. Das die Hemmung der MARKK dabei durch die Bindung der beiden Kinasen erfolgt und nicht über Phosphorylierung vermittelt wird, kann aus den Daten der Aktivitäts-Assays geschlussfolgert werden.
Die untersuchte Wechselwirkung zwischen MARKK und TESK1 stellt einen neuen Knotenpunkt zur Regulation der Mikrotubuli- und Aktin-Organisation in der Zelle dar und ermöglicht eine direkte Koordination der beiden Zytoskelett-Komponenten. Auch im Hinblick auf die mögliche Rolle von MARKK bei der Bildung von hyperphosphorylierten Tau-Aggregaten in der Alzheimer Krankheit wäre eine weiterführende Analyse der Interaktion von MARKK und TESK1 interessant.






Kurzfassung auf Englisch: The signaling from MARKK/TAO1 to MARK/Par1 to phosphorylated MAPs renders microtubules dynamic and plays a role in neurite outgrowth or polarity development. Since hyperphosphorylation of Tau at MARK target sites is a hallmark of Alzheimer neurodegeneration we searched for upstream regulators by the yeast two-hybrid approach and identified two new interaction partners of MARKK, the scaffold protein Spred1 and the kinase TESK1. Spred1-MARKK binding has no effect on the activity of MARKK and therefore does not change MT stability. Spred1-TESK1 binding causes inhibition of TESK1. Since TESK1 can phosphorylate cofilin and thus stabilizes F-actin stress fibers, the inhibition of TESK1 by Spred1 makes F-actin fibers dynamic. A third element in this interaction triangle is that TESK1 binds to and inhibits MARKK. Thus, in CHO cells the elevation of MARKK results in MT disruption (via activation of MARK/Par1 and phosphorylation of MAPs), but this can be blocked by TESK1. Similarly, enhanced TESK1-activity results in increased stress fibers (via phospho-cofilin), but this can be blocked by elevating Spred1. Thus, the three-way interaction between Spred1, MARKK, and TESK1 represents a pathway for cross-talk between the regulation of both the microtubule- and F-actin cytoskeleton.

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