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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-34628
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3462/


Functional Analysis of Hepatitis B Virus Variants with Mutations in the Envelope Proteins

Funktionsanalyse bei Hepatitis Virus B Varianten mit Mutationen der Hüllproteine

Riu Garcia, Ana

Originalveröffentlichung: (2007) Kalinina T, Riu A, Will H and Sterneck M. (2003) Selection of Secretion-incompetent Mutant in the Serum of a Patient with severe Hepatitis B. Gastroenterology. 125(4):1077-84
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Basisklassifikation: 35.76 , 42.13 , 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.05.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 30.10.2007
Kurzfassung auf Englisch: Liver inflammation caused by infection of hepatocytes with Wildtype Hepatitis B Virus (HBV), designated hepatitis B, appears to be mediated exclusively by immune-system mediated mechanisms. In fulminant hepatitis B (FHB), a particular severe and often lethal course of HBV infections, directly cytotoxic HBV variants and their enhanced immune recognition are believed to play an important role. One class of variants found in patients with FHB are defective in viral secretion for unknown reasons. In order to get more information on the structure and function of such variants, HBV genomes derived from serum and liver of an FHB-patient were characterized in this thesis.
First, it was analysed whether HBV variants identical in sequence to those previously reported to occur in serum of this patient are also present in a liver biopsy taken from him. The same complex mutations were detected in both samples arguing for their possible pathogenetic relevance in FHB. One of the cloned full-length genomes, designated variant 5a, was found to be competent in replication but secreted much less viral particles than Wild type (<2%) when tested by transfection of hepatoma cells. By mutational analysis the secretion deficit was demonstrated to be primarily due to a Cys138Arg mutation in the small envelope protein sequence. This protein is designated HBs or alternatively S-domain in the large envelope protein L, which has in addition an amino-terminal domain, designated PreS1. The same mutations in the S-domain at the carboxyl-terminal end of the large envelope protein of variant 5a did not interfere with viral particle secretion, indicating that its function depends both on the sequence context and conformation of the protein. Reversion of the Arg138 to Cys in genome 5a partially restored secretion of subviral particles and virions (about 50%) whereas mutation of Cys138Arg and Cys138Ala in Wild type context reduced viral particle secretion to 10% and 30%, respectively. In the Wild type context virion secretion was abrogated by both mutations to undetectable level suggesting an essential role of Cys138 in virion envelopment and secretion. These data, gene domain swapping and complementation experiments provided also evidence for negative contributions of mutations outside of the envelope protein coding genes to the secretion phenotype of variant 5a and chaperon-like interactions between the small and large envelope proteins. Variant 5a exhibited no increase in intracellular viral particles but enhanced large envelope protein degradation by the proteasome. Both factors are presumably important for virus production sufficient for persistence and enhanced immune recognition of variant 5a. By immune fluorescence staining the mutant envelope proteins of variant 5a were localized aberrantly to a specific perinuclear zone, a possible consequence or inducing principle of the secretion deficit and may have contributed to virus-induced cell stress and FHB pathogenesis.
This study provides novel knowledge on the structure and function of secretion deficient, but replication and complementation competent HBV variants, which probably play an important role in the pathogenesis of FHB.
Kurzfassung auf Deutsch: Lebererkrankungen, die durch Infektionen mit Wildtyp-Hepatitis-B-Virus (HBV) hervorgerufen werden, sind vermutlich ausschließlich auf Immunsystem-vermittelte Mechanismen zurückzuführen. Bei der fulminanten Hepatitis B (FHB), einer besonders schweren Lebererkrankung mit häufig tödlichem Verlauf, scheinen jedoch direkt zytotoxische HBV-Varianten und deren besonders gute Erkennung durch das Immunsystem eine wichtige Rolle zu spielen. Ein Klasse von HBV-Varianten, die man im Serum eines Patienten gefunden wurde, ist durch Defizite in der Viruspartikelsekretion gekennzeichnet. Um mehr Informationen über solche HBV-Varianten zu generieren, wurden in dieser Dissertationsarbeit HBV-Genome eines Patienten mit FHB sowohl strukturell als auch funktionell charakterisiert.
Zunächst wurde untersucht, ob HBV-Varianten mit identischer Sequenz in einer Leberbiopsie des gleichen Patienten vorkommen, wie sie zuvor im Serum dieses Patienten gefunden worden waren. Die Sequenzanalyse offenbarte die gleiche Art und eine Vielzahl von Mutationen in beiden Proben, ein Indiz für ihre mögliche Relevanz für das pathogenetische Geschehen bei der FHB. Eines der klonierten Genome mit der Bezeichnung “Variante 5a” erwies sich als replikationskompetent, sekretierte jedoch sehr viel weniger Viruspartikel (<2%) als das ebenfalls durch Transfektion von Hepatomazellen getestete Wildtyp-HBV. Durch Mutations- sowie Funktionsanalysen konnten als Hauptursache für den Sekretionsdefekt ein Austausch von Cystein zu Arginin an Position 138 in der Sequenz des kleinen Hüllproteins ausgemacht werden. Dieses Protein wird mit HBs bezeichnet, die gleiche Sequenz ist jedoch auch als carboxy-terminale Domäne im großen Hüllprotein L vorhanden und wird daher auch als S-Domäne bezeichnet. Die amino-terminale Domäne des L-Proteins wird mit PreS1 bezeichnet. Die Einführung der gleichen Mutationen in die S-Domäne des L-Proteins, die beim HBs Viruspartikelnsekretion verhinderten, hatten keine Blockade der Sekretion von Viruspartikeln zur Folge. Dies impliziert, dass die Funktion von Mutationen in der S-Domäne sowohl vom Sequenzkontext als auch von der Konformation des entsprechenden Proteins abhängt. Die Reversion der Mutation von Arg138 zu Cys an Position 138 bei der HBV-Variante 5a löste den Sekretionsblock für subvirale Partikel und Virionen nur teilweise auf (ca. 50% Wildtypeffizienz). Die Einführung der Mutationen Cys138Arg und Cys138Ala im Wildtype HBV-Sequenzkontext reduzierte die Sekretion von subviralen Partikeln um 90% bzw. 70% und hatte darüber hinaus eine komplette Blockade der Sekretion von Virionen zur Folge. Letzteres spricht für eine essentielle Funktion von Cys138 bei der Virionenbildung und Sekretion. Diese Ergebnisse, Domänenaustausch- sowie Kommplementations-experimente ergaben zudem Indizien sowohl für negative Einflüsse von Mutationen außerhalb der Hüllproteinsequenzen auf die Viruspartikelsekretion als auch für eine Chaperon-ähnliche Wechselwirkungen zwischen HBs und dem L-Protein. Intrazellulär wurde trotz des Sekretionsdefekts keine Akkumulation von Viruspartikeln der HBV-Variante 5a beobachtet, es zeigte sich jedoch verstärkte L-Proteindegradation durch Proteasomen. Beide Faktoren könnten zur ausreichenden Virusproduktion und der Persistenz der HBV-Variante 5a als auch für dessen vermutlich verstärkte Immunerkennung im Vergleich zum Wildtyp-Virus beitragen. In Immunfluoreszenzstudien wurde bei 2 der HBV-Variante 5a eine aberrante subzelluläre Lokalisation der Hüllproteine in einer Zellkernrandzone beobachtet. Dies könnte eine Konsequenz oder Auslöser der Sekretionsdefekts sein sowie zum pathogenetischen Geschehen bei der FHB beitragen.
Zusammengenommen liefert diese Studie neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion von sekretionsdefekten, aber replikations- und komplementationskompetenten HBV-Varianten, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Hepatopathogenese der FHB spielen.

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