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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-34743
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2007/3474/


Mutational Analysis of KCNQ1 (Kv7.1) channel gating

Ma, Lijuan

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Basisklassifikation: 42.13 , 42.12
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 15.11.2007
Kurzfassung auf Deutsch: KCNQ Kanäle (Kv7) repräsentieren eine Familie von spannungsabhängigen Kaliumkanälen, die ein große Rolle bei der neuronalen und kardialen Erregbarkeit spielen. Zusammen mit der Beta-Untereinheit KCNE1 bildet KCNQ1 den IKS Strom im Herzen, der für die Repolarisierung des Herzaktionspotentials von großer Bedeutung ist. Obgleich KCNQ1 von großer physiologischer Bedeutung ist, sind die Konformationsänderungen (Gating), die der Kanal beim Öffnen und Schließen sowie bei der Inaktivierung durchläuft, weitestgehend unbekannt.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Gating-Eigenschaften mittels einer Scanning-Mutagenese-Analyse zu untersuchen. Dazu wurden alle Aminosäuren innerhalb der Porenregion (G245 bis V355) systematisch zu einem kleinen Molekül (Alanin) und zu einem großen Molekül (Tryptophan) mutiert. Die mit der entsprechenden Mutation versehene cRNA wurde in Xenopus Oozyten injiziert und die Auswirkungen der Mutation auf die spannungsabhängige Aktivierung, die Leitfähigkeit und die Inaktivierung mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme untersucht. Änderungen in der relativen Rb+/K+-Leitfähigkeit und das Ausmaß der Inaktivierung wurden als Indikator für strukturelle Änderungen innerhalb der Porenregion verwendet. Das erlaubte die Unterscheidung zwischen lokalen und globalen strukturellen Veränderungen, die durch die Mutation hervorgerufen wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass sich das Gating von KCNQ1 sehr stark von dem Gating eines anderen spannungsgesteuerten Kanals, Shaker, unterscheidet. Dieser Kanal ist in Studien einer anderen Arbeitsgruppe einer ähnlichen Scanning-Mutagenese-Analyse unterzogen worden. Die KCNQ1-Porenmutanten zeigen eine Änderung der halbmaximalen Aktivierung (V1/2), nicht aber der Steilheit (z) der Aktivierungskurve (G-V). Im Gegensatz dazu zeigen Porenmutanten von Shaker sowohl eine Änderung von V1/2 als auch vom z-Wert, der ein Maß für die Kooperativität ist. Eine Verschiebung von V1/2 zu negativeren Potentialen ist begleitet mit einem höheren z-Wert (Zunahme der Kooperativität), eine Verschiebung zu positiveren Potentialen mit einem geringen z-Wert (Abnahme der Kooperativität). Es wird angenommen, dass Mutationen in der Pore von Shaker den letzten, kooperativen Öffnungsschritt, der spannungsunabhängig ist, beeinflussen. Das ist nicht der Fall für KCNQ1. Eine mögliche Erklärung für das veränderte Gating-Verhalten von KCNQ1 ist, dass Mutationen in der Porenregion von KCNQ1 frühere, spannunsabhängige Übergangsschritte beeinflussen, nicht aber den letzten Öffnungsschritt. Die Analyse der Schließkinetik (Deaktivierung) deuten allerdings darauf hin, dass die meisten KCNQ1-Mutationen den letzten Öffnungsschritt beeinträchtigen.
Im Gegensatz zu Shaker besitzt KCNQ1 eine langen C-Terminus, an dem der Kalziumsensor Calmodulin bindet. Die Applikation von unterschiedlichen Kalziumkonzentration (0-100 nM) auf die intrazelluläre Seite der Zellmembran (Inside-out-Patch) zeigte, dass Kalzium eine Verschiebung der G-V-Kurve von KCNQ1 zu negativeren Potentialen verursacht. Die Kalziumsensitivität scheint durch Calmodulin vermittelt zu werden, da die Zugabe des Calmodulin-Antagonisten W-7 zu einer starken Inhibition des KCNQ1-Stroms führt. Zusätzlich habe ich Mutationen innerhalb der Porenregion identifiziert, die die Kalziumsensitivität beeinträchtigen bzw. ganz unterbinden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Gating von KCNQ1 sowohl über die Spannung als auch über Kalzium/Calmodulin kontrolliert wird, was die unterschiedlichen Gating-Kinetiken von Shaker und KCNQ1 erklären könnte.
KCNE1 besitzt eine einzelne Transmembrandomäne und ist eine Beta-Untereinheit von KCNQ1. Die Koexpression von KCNQ1 und KCNE1 führt zu einer Verlangsamung der Aktivierungskinetik, einer Verschiebung der Aktivierungskurve zu positiveren Potentialen, Aufhebung der Inaktivierung und Veränderung der relativen Leitfähigkeit für Rubidium und Kalium.
Bei der Untersuchung der Interaktion von KCNE1 mit der Pore von KCNQ1 zeigte sich, dass die durch KCNE1 hervorgerufenen Gating-Eigenschaften durch Porenmutationen unterdrückt werden können. Das legt den Schluss nahe, dass KCNE1 über spezifische Positionen mit der Pore von KCNQ1 interagiert.
Kurzfassung auf Englisch: KCNQ channels (Kv7) represent a family of voltage-gated K+ channels that play a major role in brain and cardiac excitability. Coassembly of KCNQ1 and the KCNE1 beta subunit produces the IKs current that is crucial for repolarization of the cardiac action potential in the heart. Despite its physiological importance, the gating mechanism of KCNQ1 remains undetermined.
The objective of this study is to investigate the gating properties of the KCNQ1 channel by mutagenesis scanning. For this purpose, each residue in the KCNQ1 pore region (from G245 to V355) was systematically mutated into a small residue (alanine) and/or a bulky residue (tryptophan). cRNAs encoding the mutant channels were injected into Xenopus oocytes and the mutational effects on the voltage-dependent activation, conductance and inactivation were evaluated by the two-electrode voltage clamp technique. Changes in GRb/GK and the extent of inactivation caused by KCNQ1 mutations were used as indicators for structural changes in the pore. This allowed evaluation of whether the mutation produces a local or a global structural change at an intuitive level, which provides more insight into the mutational effects on channel gating.
The results suggest that the gating mechanism of KCNQ1 is quite different from that of Shaker which was studied extensively via mutagenesis scanning before. Remarkably, KCNQ1 pore mutations perturb gating by changing half voltage for activation (V1/2), but almost not the slope (z) of the activation curves. In contrast, Shaker pore mutations change V1/2 and z cooperatively, such that a negative shift of V1/2 is accompanied with a steep increase in z. The gating mechanism of the Kv channel is thought to involve relatively independent voltage-dependent movements within each of the four subunits followed by a concerted pore opening transition step.
Shaker pore mutants are believed to mainly influence the final cooperative opening step. This is not the case for KCNQ1. A possible explanation for the gating behavior of KCNQ1 is that KCNQ1 mutants might affect ‘early’ voltage-dependent transition steps in each subunit but not a concerted transition process. However, analysis of deactivation kinetics suggests that most KCNQ1 mutants do affect the final concerted opening step. KCNQ1 gating may involve a different mechanism.
In contrast to Shaker, KCNQ1 possesses a large C-terminus where the binding sites for a Ca2+ sensor Calmodulin have been identified. In this study, the results from inside-out patch clamp experiments show that an increase in [Ca2+] from 0 to 100nM induces a leftward shift in G-V curves of KCNQ1 channels. Application of the Calmodulin antagonist W-7 markedly inhibits the KCNQ1 currents, suggesting that Calmodulin mediates the Ca2+ regulation of the KCNQ1 channel. Additionally, I have identified the KCNQ1 pore mutations which attenuate the Ca2+ sensitivity. These results suggest that the gating of KCNQ1 is dually controlled by voltage and Ca2+, which might account for the different gating kinetics of KCNQ1 and Shaker channels.
KCNE1 is an ancillary beta subunit with a single transmembrane domain. Assembly of KCNE1 with KCNQ1 leads to a great change in the pore gating properties, e.g. slowing down the activation kinetics, positive shift of the voltage-dependent activation curve, deletion of inactivation and alteration in GRb/GK. The interaction of KCNE1 with the KCNQ1 pore has been further explored in this study. Loss of KCNE1 gating modulation caused by some KCNQ1 pore mutations suggests that KCNE1 might interact with KCNQ1 pore through specific positions.

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