FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-35146
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3514/


Untersuchungen zur Expression der Ac-Transposase aus Mais (Zea mays L.) in Gerste (Hordeum vulgare L.)

Analysis of the Expression of Ac-Transposase from Maize (Zea mays L.) in Barley (Hordeum vulgare L.)

Friedrich, Celia Katharina

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (2.192 KB) 


SWD-Schlagwörter: Gerste , Mais
Freie Schlagwörter (Deutsch): Transposon , transponierbare Elemente , Genetik , Transkript , Aktivität
Freie Schlagwörter (Englisch): transposon , transposable element , genetics , transcript , DNA , activity
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Lörz, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 14.01.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit hat die Aktivität von Ac-Transposase aus Mais (Zea mays L.) im heterologen System Gerste (Hordeum vulgare L.) im Rahmen der Etablierung eines ‚Transposon-Tagging’-Systems zur Insertionsmutagenese analysiert und charakterisiert.
Transponierbare Elemente sind bewegliche funktionelle Einheiten des Genoms. Für die Transposition brauchen transponierbare Elemente eine trans-aktive Transposase sowie cis-determinante ‚Terminal Inverted Repeats’ (TIR) und subterminale Sequenzmotive. Während der Transposition interagiert die Transposase mit den cis-Determinanten des transponierbaren Elements. Der teilweise Verlust der cis-Determinanten führt zur Immobilisierung des Elements (Healy et al. 1993).
Als Ausgangsmaterial sind Gerstenlinien verwendet worden, die mittels Partikelbeschuss mit den immobilisierten transponierbaren Elementen cwAc, cwAc103-807 und UbiAc transformiert worden waren.
Die Elemente cwAc und cwAc103-807 sind durch Deletion der ersten fünf Basen der 5’-TIR von Ac abgeleitet. Das Element cwAc103-807 enthält zusätzlich gegenüber dem Ac-Wildtyp-Element eine Deletion von 412 Basenpaaren im 5’-UTL (Kunze et al. 1995) und exprimiert eine N-terminal um 102 Aminosäuren verkürzte Transposase. Das UbiAc-Konstrukt (Koprek et al. 1999) exprimiert die Ac-Transposase unter der Kontrolle des Ubiquitin1-Promotors (Christensen et al. 1992).
Neben der Untersuchung auf Diploidität (3.1), vollständige Integration und Kopienanzahl der Transformationskonstrukte (3.2) ist die Expression, insbesondere die Prozessierung von Ac-Transkripten (3.3) und die Ac-Transposase-Aktivität (3.4), in stabil transformierten (3.1) Gerstenlinien untersucht worden. Für die Expression funktionsfähiger Ac-Transposase ist notwendig, dass der Genort das intakte Gen einschließlich eines Promotors und des Polyadenylierungssignals enthält.
Die per Mikrosporenkultur doppelhaploidisierten Gerstenlinien sind mittels Durchflusszytometrie, PCR und Southern-Blot über mehrere Generationen analysiert und die Vererbung des Ac-Elements ist beobachtet worden. Alle Linien sind diploid und enthalten mindestens ein vollständiges immobilisiertes Ac-Element. Bei einigen Linien tritt jedoch Segregation der Ac-Elemente auf, was darauf hinweist, dass die Doppelhaploidisierung nicht bei allen Linien erfolgreich gewesen ist.
Ac-Transkripte sind aus den Gerstenlinien cwAc, cwAc103-807 und UbiAc sowie der Maislinie P1-vv::Ac per RT-PCR isoliert, kloniert und sequenziert worden. Alle untersuchten Gerstenpflanzen produzieren korrekt gespleißte Ac-Transkripte und alternativ gespleißte Transkripte, die zusätzlich herausgespleißte Sequenzen in Exon 2 und 3 aufweisen. Die herausgespleißten Sequenzen beginnen jeweils mit der gleichen Donorspleißstelle bei Position 1581 bzw. 2729 und enden in unterschiedlichen Akzeptorspleißstellen. Solche alternativen Transkripte sind auch aus dikotylen Pflanzen wie Arabidopsis thaliana bekannt (Jarvis et al. 1997, Martin et al. 1997). Auch in Mais treten alternativ gespleißte Transkripte auf. Vermutlich reduziert das alternative Spleißen die Menge der zur Verfügung stehenden funktionellen Ac-Transposasemoleküle in der Zelle.
In einem eigens dafür entwickelten semi-transienten Testsystem mit dem Plasmid pUbi::mDs::GUS sind in Gerstenskutellum-Gewebe variable Transposase-Aktivitäten in vitro nachgewiesen worden. Die Aktivität von Ac nimmt in Gerste bis zu sechs Ac-Kopien mit steigender Dosis zu und bei einer höheren Anzahl Ac-Elemente wieder ab.
In homozygoten und heterozygoten Pflanzen einer Linie, die bis zu vier unabhängige Ac-Elementkopien enthält, kann beobachtet werden, dass in Gerste die Ac-Aktivität bei bis zu sechs Ac-Elementen im Genom zunimmt. Bei mehr Ac-Elementen nimmt die Aktivität wieder ab. Möglicherweise ist die Ursache für die Autosuppression jedoch nicht das alternative Spleißen, da dieses außer in Gerste und Arabidopsis thaliana (Jarvis et al. 1997, Martin et al. 1997) auch im Ursprungsorganismus Mais auftritt, sondern die Bildung von Ac-Transposase-Aggregaten.
Weder der verwendete Promotor noch die Deletion des 5’-UTL und der ersten 102 Aminosäuren haben einen direkten Einfluss auf die Aktivität von Ac in Gerste. Die genetische Umgebung der einzelnen Ac-Loci beeinflusst die Expression und Aktivität von Ac, wie durch Linien mit mehreren unterschiedlich aktiven Loci gezeigt worden ist.
Es sind mehrere Linien mit hoher Ac-Aktivität bestimmt worden, die bereits für Kreuzungsversuche verwendet wurden (Lazarow 2006). Das ‚Transposon-Tagging’-System ist damit etabliert und einsatzbereit.
Kurzfassung auf Englisch: The purpose of this work is to analyse and characterize the activity of the Ac-transposase from maize (Zea mays L.) in the heterologous organism barley (Hordeum vulgare L.) in order to establish a Transposon-Tagging system for insertional mutagenesis in barley.
Transposable elements are mobile functional units of the genome. Transposons require the trans-activating protein transposase and cis-determinant ‘Terminal Inverted Repeats’ (TIR) as well as subterminal sequence motives for transposition. During transposition the transposase interacts with the cis-determining sequences. The partial deletion of cis-determining sequences leads to immobilisation of the transposable element (Healy et al. 1993).
Barley lines transformed with the immobilised elements cwAc, cwAc103-807 and UbiAc via particle bombardment have been analysed. The elements cwAc and cwAc103-807 are derived from Ac by deletion of the first five bases of the 5’-TIR. 412 basepairs have been additionally deleted in the 5’-leader sequence of the element cwAc103-807. The element cwAc103-807 codes for a truncated transposase lacking 102 aminoacids at the N-terminus. The UbiAc-construct (Koprek et al. 1999) contains the Ac-transposase under the control of the Ubiquitin1-promoter (Christensen et al. 1992).
The transgenic lines have been tested for diploidity of their genomes (3.1), complete integration and number of inserted constructs (3.2), as well as the expression of the transposase. Attention was focused on the processing of transcripts (3.3) and the Ac-transposase-activity (3.4) in stably transformed barley lines. Loci containing an intact transposase-gene including a promoter and a poly adenylation site are vital for the expression of functional Ac-transposase.
Homozygous barley lines have been generated via microspore culture and analysed by flow-cytometry, PCR and Southern-blotting over several generations. All barley lines are diploid and contain at least one complete immobilised Ac-element. Segregation of the transgene is detected in some lines, suggesting that not all lines are double-haploid.
Ac-transcripts have been isolated via RT-PCR and sequenced from the barley lines cwAc, cwAc103-807 and UbiAc as well as the maize line P1-vv::Ac. All lines produce correctly spliced Ac-transcripts and additionally alternatively spliced transcripts lacking sequences in exons 2 and 3. The deleted sequences begin at the same splice donor site at position 1581 or 2729 and end at different acceptor sites. Similar alternative transcripts have been previously isolated from the dicotyledoneus Arabidopsis thaliana (Jarvis et al. 1997, Martin et al. 1997). Alternatively spliced transcripts can also be isolated from maize. Alternative splicing probably reduces the amount of available and functional Ac-transposase in the cell.
Variable transposase-activity has been demonstrated in vitro with a specially designed semi-transient test with the plasmid pUbi::mDs::GUS. The activity of Ac in barley increases with Ac-dosage. In the analysed lines an activity maximum was reached with six Ac-copies in the barley genome. Homo- and heterozygous individuals of one line containing up to four independent Ac-elements show that the activity of Ac increases with the number of Ac-copies.
Probably the cause for the auto-suppression of Ac is not the alternative splicing, as it also occurs in Arabidopsis thaliana (Jarvis et al. 1997, Martin et al. 1997), but the aggregation of the transposase-protein in the cell.
Neither the usage of the Ubiquitin1-promoter for expression of Ac nor the deletion of the first 102 aminoacids seem to have a direct effect on the activity of Ac in barley. The genetic environment of the different Ac-loci influences the expression and activity of Ac, as shown by lines with several independent loci.
Several lines with high Ac-activity have be identified and are already being used for breeding-experiments (Lazarow 2006). Hereby the Ac-based Transposon-Tagging system for barley has been successfully established.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende