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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-35389
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3538/


Molekulare Charakterisierung des CDC5-Proteins von Tomate (Solanum lycopersicum L.) und Analyse seiner Interaktion mit dem "Potato spindle tuber viroid" (PSTVd)

Molecular characterization of the CDC5-protein from tomato (Solanum lycopersicum L.) an analysis of its interaction with the Potato spindle tuber viroid (PSTVd)

Timmermann, Christina

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SWD-Schlagwörter: Potato-Spindle-Tuber-Viroid , Viroide , Tomate
Freie Schlagwörter (Englisch): Cell division cycle 5 Protein (CDC5)
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mühlbach, Hans-Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.12.2007
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 15.01.2008
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde durch molekularbiologische Analysen das cdc5-homologe Gen sowie der cdc5-spezifische Promotorbereich der Tomate (Solanum lycopersicum L.) identifiziert und charakterisiert. Darüber hinaus konnte über "Gel-Shift"-Analysen mit rekombinant exprimierten CDC5 die zuvor von Werner (1995c) postulierte Interaktion von CDC5 mit dem "Potato spindle tuber viroid" (PSTVd) bestätigt werden.
Der partielle cDNA-Expressions-Klon pRW 19.5, welcher über die Interaktion des exprimierten Proteins mit PSTVd isoliert wurde, wies Homologie zu einem myb-ähnlichen Transkriptionsfaktor von Arabidopsis thaliana auf, der als Cell Division Cycle 5-Protein bezeichnet (CDC5) wurde. Von dieser Teilsequenz ausgehend, wurden über "RACE"-Analysen sowie "Genome-Walk"-Experimente die vollständigen cDNA- und gDNA-Sequenzen des putativen cdc5-Gens der Tomatenkultursorten Rutgers, Micro-Tom und Goldkugel erhalten, welche untereinander vollständig identisch waren. Da die abgeleitete Aminosäuresequenz von 988 AS, eine 73 %ige Homologie zu den beschriebenen CDC5-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Schizosaccharomyces pombe aufwies und zudem CDC5-charakteristische Sequenzmotive beinhaltete, wurde das Protein als CDC5-Homolog der Tomate (SlCDC5) bezeichnet. Zudem konnte, über die Verwendung von "Primer-Extension"-Experimenten und RT-PCR-Analysen, der Slcdc5-spezifische Promotor identifiziert und über GFP-Expressionsanalysen in Mesophyllprotoplasten funktionell charakterisiert werden.
Ein Vergleich der bisher bekannten CDC5-Proteine zeigte, dass nur SlCDC5 einen verlängerten C-Terminus aufwies, der zwei Sequenzwiederholungen, als VEPS und VTKT bezeichnet, enthielt. Da dieser Bereich für die Bindung an das Viroid von Bedeutung sein könnte, wurde der C-terminale Sequenzbereich des CDC5-Proteins von Nicotiana rustica, einer Viroid-Nicht-Wirtspflanze analysiert. Die abgeleitete CDC5-Sequenz von Nicotiana rustica wies eine mit Tomate vergleichbare VTKT-Wiederholung auf, zeigte jedoch anstelle der VEPS-Wiederholung zweifach die Sequenz VESSET. Dagegen war bei der Kartoffel, als ursprünglichen Wirtspflanze für PSTVd, neben der VEPS-Wiederholung sogar viermal das VTKT-Motiv im CDC5-Protein zu finden. Um die mögliche Interaktion von PSTVd und SlCDC5 analysieren zu können, wurden Tri-Hybrid-Studien durchgeführt. Obwohl alle Interaktionspartner gebildet wurden, was über Northern- und Western-Blot Analysen geprüft wurde, war eine Interaktion von PSTVd mit unterschiedlichen SlCDC5-Konstrukten im Tri-Hybrid System nicht nachweisbar. Daher wurden "Gel-Shift"-Analysen mit rekombinanten SlCDC5 und PSTVd durchgeführt. Hierbei ließ sich nachweisen, dass das 467 AS lange C-terminale CDC5-Konstukt das Viroid vollständig retardierte, während das verkürzte 169 AS lange äußerste C-terminale Ende nur zu einer geringen Retardierung führte. Somit kommt auch dem N-terminal gelegenen Bereich außerhalb der auffälligen Sequenzmotive VTKT und VEPS eine Bedeutung für die Bindung von PSTVd zu.

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