Adenovirale Gentherapie des adrenokortikalen Karzinoms : In vitro Studien zur Transduzierbarkeit adrenokortikaler Zelllinien

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem experimentellen Ansatz aus dem Bereich der antitumoralen Zytokingentherapie und dessen Anwendung auf das adrenokortikale Karzinom. Bei dieser Therapieform werden die antitumoralen Effekte von Zytokinen ausgenutzt, im vorliegenden Fall von Interleukin-12 und Interleukin-18. Um die Zytokine, die bei systemischer Applikation eine hohe Toxizität aufweisen, an ihren Wirkungsort zu bringen und ihre Ausschüttung vor Ort zu regulieren, kommt das adenovirale 3r-Vektorsystem zum Einsatz. Dieses therapeutische Vektorkonstrukt wird in der Zellkultur mit der murinen adrenokortikalen Zelllinie Y1 und der humanen Variante NCI-H295 analysiert. Die antitumorale Zytokingentherapie beruht auf den Prinzipien der Immuntherapie. Obwohl Tumoren aus körpereigenen Zellen entstehen, können bei Tumorpatienten tumorspezifische Immunzellen und Antikörper gefunden werden, was belegt, dass eine Immunantwort auf Tumorgewebe stattfindet. Diese beruht auf Tumorantigenen, die von körpereigenen Immunzellen erkannt werden. In vielen Fällen ist das Antigen aufgrund der Ähnlichkeit zu gesundem Gewebe jedoch zu schwach, es fehlen Kostimulatoren oder tumoreigene Escape-Mechanismen führen dazu, dass es trotz einer Immunreaktion zur Tumorprogression kommt. Hier setzt die Zytokingentherapie an. Die antitumorale Wirksamkeit der Interleukine-12 und -18 beruht auf einer Stimulation der körpereigenen Immunantwort auf Tumorzellen und zusätzlich auf direkten proliferationshemmenden und antiangiogenetischen Effekten. Sie konnte bereits in verschiedenen präklinischen und klinischen Studien bewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Vektoren basieren auf einem E1/E3-deletierten Adenovirus vom Typ 5, welches die Gene für Interleukin-12 bzw. -18 unter der Kontrolle eines durch Tetracyclin regulierbaren, bidirektionalen sowie autoregulativen Promotors in die Zielzelle einschleust. Dieser leitet sich aus der Tetracyclinresistenz von Eukaryonten ab und besteht aus sieben TetO-Einheiten, welche auf einer Seite von einem minimalen CMV-Promotor flankiert sind, der das Zielgen kontrolliert. Auf der anderen Seite befindet sich ein schwächerer minimaler Thymidinkinase-Promotor des HSV, welcher die Transkription des Tetracyclin-kontrollierten Transaktivators (tTA) kontrolliert. Intrazellulär werden die Zytokingene durch wirtseigene Polymerasen abgelesen, sobald der tTA an das Tetracyclin-responsible Element auf der Vektor-DNA bindet und so die Transkription initiiert. Durch die Zugabe geringer Mengen des Antibiotikums Tetracyclin wird die Produktion gedrosselt, da es den tTA bindet und so keine Aktivierung mehr stattfindet. Durch den autoregulativen Aspekt des 3r-Systems entsteht im angeschalteten Zustand ein positiver Feedback-Mechanismus und die Effizienz steigt. Durch die Regulierbarkeit wird das System für den klinischen Einsatz sicherer und effektiver. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die murine adrenokortikale Zelllinie Y1 und die humane Zelllinie NCI-H295 mit verschiedenen Vektoren des 3r-Systems transduziert, die die Gene für murines bzw. humanes Interleukin-12 und -18 tragen. Zu Beginn der Arbeit lagen bereits erfolgreiche Daten zum Einsatz des 3r-Systems in anderen Zelllinien vor, insbesondere beim Kolonkarzinom. Für adrenokortikale Zelllinien gab es bis dahin jedoch keinen Bericht über die erfolgreiche Anwendung eines durch Tetracyclin regulierbaren Systems. Es wird bewiesen, dass beide getesteten Zelllinien mit Vektoren des 3r-Systems transduzierbar sind, das Zytokin dosisabhängig produzieren und durch Doxyxcyclin in ihrer Produktion regulierbar sind. Im Vergleich mit der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 ist festzustellen, dass Y1-Zellen weniger Interleukin produzieren und eine geringere Suppression durch Doxycyclin zeigen als HT29-Zellen, die Vektoreffizienz also zelllinienabhängig ist. Es wird zudem deutlich, dass der für murines Interleukin-18 kodierende Vektor des 3r-Systems im Vergleich zum Interleukin-12 tragenden als viel ineffizienter einzustufen ist. Für die humane adrenokortikale Zelllinie NCI-H295 gab es bisher kaum Daten über ihre Transduzierbarkeit mit Adenoviren im Allgemeinen. Es kann gezeigt werden, dass sie mit verschiedenen adenoviralen Vektoren transduzierbar sind und das 3r-System in punkto Dosisabhängigkeit und Supprimierbarkeit verlässlich funktioniert. In einer letzten Versuchsreihe wird bewiesen, dass auch ein weiterer 3r-Vektor, der für humanes Interleukin-12 kodiert und damit für den Einsatz am Menschen geeignet ist, NCI-H295-Zellen in vitro erfolgreich transduziert. Die vorliegende Arbeit ist der erste Bericht über die Anwendung eines durch Tetracyclin regulierbaren Systems auf die Nebennierenrinde. Sie bildet eine erste Grundlage für die weitere Erforschung der Zytokingentherapie als ergänzende Therapieoption für das adrenokortikale Karzinom.

This thesis evaluates an experimental approach from the field of cytokine gene therapy for the treatment of adrenocortical cancer. The treatment relies on the antitumor effects of the cytokines interleukin-12 and interleukin-18. As they have showed a high toxicity previously when they were given systemically, an adenoviral vector from the 3r vector system is used to apply and control them locally. This therapeutic vector construct is tested in vitro with the murine adrenocortical cell line Y1 and the human adrenocortical cell line NCI-H295. Antitumoral cytokine gene therapy is based on the principles of immune therapy. Although tumors develop from normal body tissue, tumorspecific immune cells and antibodies are found in tumor patients, which proves that an immune response to malignancies exists. It is based on tumor antigen which is recognized by immune cells. But in many cases there is a tumor progression despite the immune reaction, as the antigen is too weak because of its similarity to healthy tissue, costimulatory molecules are missing or the tumor uses escape mechanisms. This is where cytokine gene therapy comes in. Interleukin-12 and interleukin-18 exhibit their antitumor effects by stimulating the body's immune response to malignant cells and additionally act antiangiogenetic and antiproliferative. These effects have been proved by many preclinical and clinical studies. The 3r vector system was built from an E1/E3-deleted adenovirus type 5, which carries the gene sequences of interleukin-12 and interleukin-18 under the control of a tetracycline-regulatable bidirectional and autoregulative promoter. It is derived from the tetracycline resistance operon of E. coli. It consists of seven tetO, which are flanked by a minimal CMV-promoter on one side, which controls the cytokine gene, and a weaker minimal TK-promoter of HSV on the other side, which controls the transcription of the tetracycline-controlled transactivator (tTA). The cytokine genes are read by the host's polymerases as soon as the tTA binds to the tetracycline-responsive element on the vector DNA and initiates the bidirectional transcription. The addition of little doses of the antibiotic doxycycline turns down the production because it binds the tTA and stops it from activating the transcription. In the active stage a positive feedback mechanism based on the autoregulative loop increases the system's efficiency. The ability to be regulated by small doses of doxycycline makes the system safer and more effective for its clinical use. In this thesis the murine adrenocortical cell line Y1 and the human adrenocortical cell line NCI-H295 are transduced by different 3r vectors, which carry the genes for murine or human interleukin-12 and interleukin-18. At the beginning of this work, our team had already used these vectors successfully in other cell lines, especially in colon carcinoma. But there was no single report on the use of a tetracycline-regulatable system for the adrenal cortex. This thesis shows that both tested cell lines can be transduced by 3r vectors, that the cells produce interleukins in a dose-dependent manner and are regulatable by the antibiotic doxycyline. Compared to the human colon carcinoma cell line HT29, Y1 cells produce less cytokines and are less regulatable than HT29, which means that the efficiency of these vectors is dependent on the cell line. The 3r vector which encodes for murine interleukin-18 is showed to be less effective in comparison with the interleukin-12 producing one. There was very few data on the NCI-H295 cell line and its susceptibility to transduction by adenoviruses and adenoviral vectors. It is proved that these cells can be transduced by different adenoviral vectors and that the 3r systems is effective concerning dose-dependent cytokine production and regulation. In a last series of tests it becomes clear that another 3r vector, which carries the gene for human interleukin-12 and therefore could be used in a clinical setting, successfully transduces NCI-H295 in vitro. This thesis is the first report about the use of a tetracycline-regulatable system for the adrenal cortex. It is a basis for the further evaluation of cytokine gene therapy as an additional treatment option for patients with adrenocortical cancer.