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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36058
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3605/


Funktionelle Interaktionen von p53 mit Telomerasekomponenten und Regulation der Telomeraseaktivität durch p53

Functional Interactions between Telomerase and p53 and Regulation of Telomerase by p53

Iwanski, Kamila Irena

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Telomerase , Telomere , p53
Freie Schlagwörter (Englisch): Telomerase , Telomeres , p53
Basisklassifikation: 44.03
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.02.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 11.03.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Das Tumorsuppressorprotein p53 ist ein Multifunktionsprotein, dessen Funktionen hauptsächlich in der Überwachung des Zellteilungsprozesses und des Replikationsvorganges liegen. Die wichtigste Aufgabe des p53-Proteins ist die Aufrechterhaltung der Integrität der genetischen Information. Es wird auch als „Wächter des Genoms“ bezeichnet.
Die Telomerase ist ein Enzym, welches in der Lage ist, Chromosomenenden, die Telomere, bei der Replikation zu verlängern. Sie besteht aus mindestens drei Komponenten, der katalytischen Untereinheit hTERT, der RNA-Untereinheit hTERC und DKC1, dem Dyskerin Protein. Darüber hinaus ist der Telomerasekomplex mit dem TEP1 Protein, dessen Funktion bislang unbekannt ist, assoziiert. Die Telomerase ist beim Menschen lediglich in stark proliferierenden somatischen Zellen, wie den Korneazellen des Auges, aber auch in den Geschlechtszellen aktiv. In allen anderen Zellen ist die Telomerase reprimiert. Auf der anderen Seite ist die Telomerase in den meisten menschlichen Tumoren aktiviert.
Auch das Tumorsuppressorprotein p53 ist in über der Hälfte der menschlichen Tumoren in seinen Funktionen gestört und inaktiv. Da p53, die Telomere und Telomer-assoziierte Proteine zentrale Komponenten des komplexen zellulären Überwachungs- und Reparatursystems der Zelle sind und die Telomerase normalerweise nicht aktivert ist, wird ein Zusammenhang zwischen der Regulation der Telomeraseaktivität und p53 vermutet. Ob und welche Interaktionen zwischen p53, Telomeren und Telomerasekomponenten stattfinden, ist bisher nicht ausreichend geklärt.
Ziel dieser Doktorarbeit war es einerseits, mögliche regulative Zusammenhänge des Tumorsuppressorproteins p53 und der Telomerase auf Transkriptionsebene zu untersuchen. Dieses wurde anhand der humanen Tumorzelllinien H1299 und HCT116 untersucht, welche Telomerase positiv sind und in denen p53 entweder endogen (HCT116) exprimiert wird oder ektopisch und induzierbar (H1299) überexprimiert werden kann. Die Experimente mit beiden Zelllinien zeigten, dass die Induktion von p53, sowohl im ektopen als auch im endogenen System, mit einer Hemmung der hTERT Expression einherging. Es besteht also ein Zusammenhang zwischen p53 und der Regulation der hTERT Expression auf transkriptioneller Ebene.
Andererseits sollte untersucht werden, ob Interaktionen zwischen p53 und Telomerase auf Proteinebene stattfinden. Dazu wurde im TRAP-Assay, einer sehr sensitiven Methode zum Nachweis von Telomeraseaktivität, gereinigtes Wildtyp-53 (wtp53) zu Telomerase positiven Kernextrakten aus HeLa-Zellen gegeben. Es zeigte sich, dass die Telomeraseaktivität in Abhängigkeit von der Konzentration des gereinigten p53 abnimmt, p53 die Telomeraseaktivität also hemmen kann. Dieses Ergebnis konnte auch beim Einsatz von gereinigten p53-Mutanten (mutp53) beobachtet wurden, was zunächst verwunderlich ist, da mutp53 und Telomerase in vielen Tumoren gemeinsam vorliegen. Eine eindeutige Antwort auf dieses unerwartete Resultat konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gefunden werden. Vermutlich kommt es zu einer Bindung von p53 bzw. mutp53 an TEP1, die Protein- assoziierte Untereinheit der Telomerase. In einem weiteren Versuch wurden deshalb Telomerase positiven Kernextrakten zusätzlich zu wtp53 auch synthetisierte TEP1 Peptide hinzugegeben, um herauszufinden, ob p53 und TEP1 interagieren können. Hierbei stellte sich heraus, dass bei gleichzeitiger Zugabe von wtp53 und einem TEP1 Peptid die Telomeraseaktivität nicht abnimmt. Das kann als Hinweis gelten, dass das TEP1 Peptid die Bindung von p53 an die Telomerase verhindert und somit die Unterdrückung der Telomeraseaktivität durch p53 aufheben kann.
Man kann also zusammenfassend sagen, dass p53 sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranslationaler Ebene an der Regulation der Telomerasefunktion beteiligt ist.



Kurzfassung auf Englisch: The tumorsuppressor p53 is a multifunctional protein and its main function is to maintain genomic stability by controlling the process of the cell cycle, acting as a transcription factor.
Telomerase is a reverse transcriptase, which is able to lengthen the ends of chromosomes,the telomeres.The enzyme consists out of three main components, the catalytic- subunit hTERT, the RNA-subunit hTERC and the Dyscerin Protein. Furthermore it is associated with the protein TEP1.The function of TEP1 is not clear, but it could be the link between Telomerase and p53. Human telomerase is only activated in strongly proliferating somatic tissues, such as cornea cells and in germ cells. In all the other human somatic tissues telomerase should be inactivated. However, in most of the human tumors Telomerase is activated. Interestingly p53 is mutated or inactivated in over 50% of the human tumors, so this could be a hint on regulation between p53 and telomerase activity in the normal tissue. The aim of this work was to investigate if there are any interactions between p53 and telomerase and if yes, under which physiological conditions does p53 regulate telomerase activity. Therefore two human tumor cell lines were used for in vitro experiments. The H1299 cells are lung carcinnoma cells which present a system of ectopic p53 expression. The HCT116 cells are cells out of a colon carcinoma and present an endogenous system of p53 expression. In both cell lines p53 expression was induced by treatment with gamma rays or tetracyclin and the effects of p53 on telomerase activity and hTERT expression were investigated by using molecular biological methods. In another experiment synthetic TEP1 protein was added to telomerase positive extracts with purified p53 and the inhibition of telomerase activity diminished. The results show that there is an inhibition of telomerase activity on protein level as well as on transcriptional level by repression of hTERT expression by p53. However these results are obviously strong in the H1299 cells, but not in the HCT116 cells, which present the more natural system of p53 expression. Further experiments have to follow to prove the inhibition of telomerase activity by p53 in vivo and to figure out on which mechanism this could be based.

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