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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36622
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3662/


Isolierung und Charakterisierung von inhibitorischen Einzeldomänen-Antikörpern aus dem Lama (Lama glama L., 1758) gegen die T-Zell-Ekto-ADP-Ribosyltransferase 2.2 der Maus (Mus musculus L., 1758)

Isolation and characterization of inhibitory single domain antibodies from llama (Lama glama L., 1758) against T cell ecto-ADP-ribosyltransferase 2.2 from mouse (Mus musculus L., 1758)

Reyelt, Jan

Originalveröffentlichung: (2008) KOCH-NOLTE, F., REYELT, J., SCHOSSOW, B., SCHWARZ, N., SCHEUPLEIN, F., ROTHENBURG, S., HAAG, F., ALZOGARAY, V., CAUERHFF, A. & GOLDBAUM, F. A. (2007). Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. Faseb J 21, 3490-3498.
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Freie Schlagwörter (Deutsch): VHH , Einzeldomänen-Antikörper , kameliden Antikörper , inhibitorische Antikörper , ADP-Ribosyltransferase , Phagen Display , Lama , Kristallisation
Freie Schlagwörter (Englisch): VHH , single domain antibodies , camelid antibodies , inhibitory antibodies , ADP-ribosyltransferase , phage display , llama , crystallization
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.02.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 09.05.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines Werkzeugs, das die enzymatische Aktivität der ADP-Ribosyltransferase 2.2 der Maus (mART2.2) in vitro und in vivo inhibiert. Die mART2.2 ist ein in der Membran von T-Lymphozyten verankertes Toxin verwandtes Ekto-Enzym, das die Übertragung des ADP-Riboseanteils von NAD+ auf Zelloberflächenproteine katalysiert. mART2.2 induziert die Apoptose von T-Zellen durch Aktivierung des zytolytischen P2X7 Purinorezeptors durch ADP-Ribosylierung.
Die variable Domäne (variable domaine of the heavy-chains of heavy-chain-only antibodies, VHH) von kameliden-typischen Schwere-Ketten-Antikörpern stellt die kleinste bekannte physiologische Antigen-bindende Einheit dar, die im Zuge einer adaptiven Immunantwort generiert wird. Die oft sehr lange CDR3 versetzt VHHs in die Lage in Spalten und Vertiefungen des Antigens einzudringen. So werden insbesondere die aktiven Zentren von Enzymen blockiert.
Zur Generierung von mART2.2-inhibierenden Schwere-Ketten-Antikörpern wurde ein Lama genetisch und mit mART2.2- Protein immunisiert. Daraufhin wurden Phagen-Display-Bibliotheken generiert, die das VHH Repertoire der B-Zellen aus einer Blutprobe des Lamas repräsentieren. Aus diesen wurden vier mART2.2-spezifische VHHs selektiert. Enzym-Tests zeigten, dass drei der vier VHHs die Aktivität der mART2.2 in vitro effizient und spezifisch inhibieren. Die Paraloge ART2.1 und mART1 bleiben unbeeinflusst. Nach intravenöser Injektion einer der mART2.2-spezifischen VHHs wurde eine Inhibition der enzymatischen und zytotoxischen mART2.2-Aktivität in lymphatischen Organen erzielt. Diese Inhibition ist schnell und reversibel. Die Blockade der mART2.2 trat bereist 15 Minuten nach Injektion ein und war nach 24 Stunden wieder weitgehend abgeklungen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, Ekto-Enzyme auf Leukozyten per intravenöser Injektion von VHHs in vivo zu blockieren und stellen zugleich die Basis für die Entwicklung neuartiger Gegengifte gegen ADP-ribosylierende Toxine dar.
Nach einer Auffrischungsimmunisierung des Lamas mit mART2.2-Protein wurde eine weitere Phagen-Bibliothek kloniert. Dabei wurde festgestellt, dass, im Gegensatz zu früheren Untersuchungen, bereits in der primären Bibliothek ein beachtlicher Anteil (> 20%) mART2.2 spezifische Klone vorhanden ist. Diese Einzeldomänen-Antikörper weisen Sequenzähnlichkeiten mit den vier zuvor entdeckten mART2.2-spezifischen VHHs auf, unterscheiden sich jedoch von diesen durch Punktmutationen. Diese Beobachtungen lassen den Ablauf einer sekundären Immunreaktion vermuten, in deren Verlauf es zur klonalen Expansion von B-Lymphozyten und Affinitätsreifung von Antikörpern gekommen ist. In drei Fällen kann ein Subklassenwechsel (sub-class switch) vom Schwere Ketten IgG3- zum Schwere Ketten IgG2-Isotyp festgestellt werden.
Im letzten Abschnitt der Arbeit wird die rekombinante Großproduktion und Aufreinigung von Einzeldomänen-Antikörpern und der mART2.2 beschrieben, mit dem Ziel einen Komplex aus VHH-Domäne und ART2.2 zu kristallisieren. In zwei von 864 getesteten Nano-Kristallansätzen konnte die Entstehung von Kristallen durch Fotos dokumentiert werden. Die Grundlage für die Röntgenstrukturanalyse wurde damit bereitet.
Kurzfassung auf Englisch: The purpose of this study was to develop a tool for blocking the enzymatic and cytotoxic activities of mouse ADP ribosyltransferase 2.2 (mART2.2) in vitro and in vivo. mART2.2 is a toxin-related leukocyte ecto-enzyme that transfers the ADP-ribose moiety from NAD+ onto other cell surface proteins. ART2.2 induces T cell death by activating the cytolytic P2X7 purinoceptor via ADP-ribosylation.
The variable domain of heavy-chain antibodies (variable domaine of the heavy-chains of heavy-chain-only antibodies, VHH) represents the smallest known antigen-binding unit generated by adaptive immune responses. Their long CDR3 endows VHH domains with the extraordinary capacity to extend into and block molecular clefts such as the active sites of enzymes.
To generate ART2.2-blocking single domain antibodies, a llama (Lama glama) was immunized by gene-gun immunization and with mART2.2 protein. After amplifying the VHH repertoire of B cells from a peripheral blood sample by polymerase chain reaction, VHH-phage display libraries were generated. From these libraries four mART2.2-specific VHHs were selected. The results of three different ADP-ribosylation sho that three of these VHHs inhibit the enzymatic activity of mART2.2 in vitro. This inhibition was highly specific for mART2.2, as it did not affect the closely related enzyme paralogs ART1 or ART2.1. Following intravenous injection, ART2.2-specific VHH domains shut off the enzymatic and cytotoxic activities of ART2.2 in lymphatic organs. This blockade was essentially complete within 15 minutes after injection and subsided 24 hours after injection.
These findings constitute a proof of principle that opens up a new avenue for targeting leukocyte ecto-enzymes in vivo by intravenous injection and that can serve as a model also for developing new antidotes against ADP-ribosylating toxins.
A new phage display library was cloned from the same llama, following a mART2.2-protein boost immunization two years after the previous one. In contrast to the libraries obtained from the previous boost, the new primary library already contained a substantial fraction (>20%) of mART2.2-specific VHHs. These and additional single domain antibodies obtained by panning, showed sequence similarities to the four known mART2.2-specific VHHs, but featured a number of point mutations. This observation is in accord with the notion of a classical secondary immune response with clonal expansion of mART2.2-specific B cells and somatic hyper mutations of the heavy-chain antibody genes. Moreover, in several cases a class switch was noticed from heavy-chain IgG3 to heavy-chain IgG2 isotype.
The last part of this thesis describes the large scale production and purification of single domain antibodies and mART2.2-protein with the aim of generating crystals of a complex of VHH and ART2.2. A nano-scale screen of 864 crystalization buffers yielded two conditions showing growth of orthorhombic crystals. These results are documented by photos and that provide a basis for future X-ray structure analyses.

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