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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36732
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3673/


The role of cardiac myosin binding protein C and its phosphorylation in the regulation of cardiac contraction

Die Rolle des kardialen Myosin-bindenden Proteins C und seiner Phosphorylierung in der Regulation der Herzkontraktion

Pohlmann, Lutz

Originalveröffentlichung: (2008) Pohlmann L, Kröger I, Vignier N, Schlossarek S, Krämer E, Coirault C, Sultan KR, El-Armouche A, Winegrad S, Eschenhagen T and Carrier L (2007) Cardiac myosin-binding protein C is required for complete relaxation in intact myocytes. Circ Res 101:928-38
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SWD-Schlagwörter: Herzmuskelzelle , Sarkomer , Kontraktion , Hypertrophie
Freie Schlagwörter (Englisch): cardiac myocytes , sarcomere , contraction , hypertrophy
Basisklassifikation: 44.38 , 44.85
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 20.05.2008
Kurzfassung auf Englisch: Cardiac myosin binding protein C (cMyBP-C, C-Protein) is a protein associated with the thick filaments in the sarcomeres of cardiac myocytes. It contributes to the thick filament structure through its various interactions with other sarcomeric proteins. After beta-adrenergic stimulation cMyBP-C is phosphorylated via cAMP-dependent protein kinase (PKA) suggesting that it has also a regulatory function in cardiac contraction. However, this regulatory role is still not fully resolved. Interest in cMyBP-C has intensified since the discovery that mutations in the gene encoding for cMyBP-C are frequent causes of familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC). The aim of the present work was to determine the role cMyBP-C plays in regulating contraction both in the absence of phosphorylation and after phosphorylation by PKA. Therefore, a targeted cMyBP-C knock-out (KO) mouse model was used, which does not express cMyBP-C and which develops cardiac hypertrophy. Contractile parameters were assessed mainly on the level of the intact myocytes where sarcomere shortening and intracellular Ca2+ transients were simultaneously measured. Further functional analysis was performed in intact left atrium and work-performing heart under loaded conditions. Protein analysis was performed to detect compensatory changes in the KO hearts.
The isolated myocytes from KO mice exhibited a markedly lower diastolic sarcomere length, which was sensitive to two inhibitors of cross-bridge cycling, indicating residual actin-myosin interaction and consequently incomplete relaxation during diastole. The relationship between cytosolic Ca2+ and sarcomere length showed that KO myocytes started to contract at a lower level of intracellular Ca2+. Furthermore, a marked increase in sensitivity to external Ca2+ concentration was observed in isolated left atria from KO mice. The kinetics of both sarcomere shortening and the intracellular Ca2+ transient were slowed in KO, which was associated with changes in the amount of proteins involved in contraction and relaxation.
After beta-adrenergic stimulation, isolated myocytes from KO displayed a more pronounced increase in fractional sarcomere shortening than myocytes from wild-type (WT) despite similar amplitudes of the Ca2+ transient. In loaded preparations, however, beta-adrenergic stimulation resulted in a lower increase of force in KO than in WT. Moreover, ligand binding to beta-adrenergic receptors was found to be increased in KO hearts. Taken together, ablation of cMyBP-C results in increased Ca2+ sensitivity under basal conditions and even more pronounced after beta-adrenergic stimulation. This obviously results in a relaxation deficit and constant contractile activation at low levels of Ca2+ during diastole. These results favor the concept that cMyBP-C acts as a constraint on myosin-actin interaction, thus allowing complete relaxation during diastole. This mechanism is of particular importance after beta-adrenergic stimulation, when the sarcomeres are highly activated, and a pre-contracted state would dramatically reduce, rather than increase, the dynamic range of contraction.
Kurzfassung auf Deutsch: Das kardiale Myosin bindende Protein C (cMyBP-C, C-Protein) ist eine Komponente der dicken Filamente in den Sarkomeren der Herzmuskelzellen. Durch zahlreiche Interaktionen mit anderen Proteinen des Sarkomers trägt es zur Stabilität der dicken Filamente bei. Nach beta-adrenerger Stimulation wird es durch die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) phosphoryliert. Dies spricht dafür, dass cMyBP-C außerdem eine Rolle in der Regulation der Kontraktion spielt. Jedoch ist diese Rolle immer noch nicht hinreichend aufgeklärt. Das Interesse an Struktur und Funktion des cMyBP-C hat zugenommen, seit bekannt ist, dass Mutationen in diesem Protein zu den häufigsten Ursachen der familiären hypertrophen Kardiomyopathie (FHC) gehören. Ziel der voliegenden Arbeit war es, die Rolle des cMyBP-C in der Regulation der Kontraktion, sowohl im nicht-phosphorylierten Zustand, als auch nach Phosphorylierung durch PKA, zu bestimmen. Dazu wurde ein cMyBP-C knock-out (KO) Maus-Modell benutzt, welches kein cMyBP-C exprimiert und Hypertrophie entwickelt. Die kontraktilen Eigenschaften wurden hauptsächlich auf der Ebene isolierter intakter Kardiomyozyten bestimmt, wobei Sarkomerverkürzung und intrazelluläre Ca2+-Transienten gleichzeitig gemessen wurden. Weiterhin wurde die Kontraktilität von intakten linken Vorhöfen und isolierten Herzen unter isometrischen Bedingungen untersucht. Bestimmung herzspezifischer Proteine wurde durchgeführt, um kompensatorische Veränderungen in den KO-Herzen zu erfassen.
Isolierte Kardiomyozyten aus den KO-Mäusen wiesen eine deutlich verringerte diastolische Sarkomerlänge auf. Diese war durch Inhibitoren der Myosin-Aktin-Querbrückenbildung umkehrbar, was dafür spricht, dass die verringerte diastolische Sarkomerlänge Folge einer residualen Aktin-Myosin-Interaktion ist. Die Beziehung zwischen zytosolischem Ca2+ und Sarkomerlänge während der Kontraktion zeigte, dass sich die KO-Kardiomyozyten schon bei geringeren intrazellulären Ca2+-Konzentrationen verkürzen als vergleichbare Wildtyp (WT)-Kardiomyozyten. Darüberhinaus wurde in den linken Vorhöfen der KO-Mäuse eine deutlich gesteigerte Sensitivität gegenüber der extrazellulären Ca2+-Konzentration beobachtet. Die Geschwindigkeiten sowohl der Sarkomerverküzung als auch der Ca2+-Transienten waren in KO-Kardiomyozyten verlangsamt, was mit Veränderungen in Proteinen, die an Kontraktion und Relaxation beteiligt sind, einherging.
Nach beta-adrenerger Stimulation der Kardiomyozyten war die Zunahme der prozentualen Sarkomerverkürzung in KO stärker ausgeprägt als in WT, trotz gleichbleibender Amplitude des íntrazellulär freigesetzten Ca2+. Im Gegensatz dazu war der Anstieg in der Kraft, die an intakten Vorhöfen bzw. isolierten Herzen unter isometrischen Bedingungen gemessen wurde, in KO geringer ausgeprägt als in WT. Die Liganden-Bindung an beta-adrenergen Rezeptoren war in KO-Herzen erhöht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Fehlen des cMyBP-C im KO zu erhöhter Ca2+-Sensitivität führt, sowohl basal als auch nach beta-adrenerger Stimulation. Dies hat eine unvollständige Relaxierung der Sarkomere und somit dauerhafte Kontraktion bei den niedrigen Ca2+-Konzentrationen, wie sie während der Diastole auftreten, zur Folge. Die Ergebnisse sprechen daher für ein Modell, in dem cMyBP-C als interne Last in den Sarkomeren wirkt, die die Myosin-Aktin-Interaktion behindert und deshalb vollständige Relaxation in der Diastole ermöglicht. Dies ist besonders nach beta-adrenerger Stimulation von Bedeutung, wenn die Sarkomere stark aktiviert sind und ein vorkontrahierter Zustand nicht mehr in der Lage wäre, das Ausmaß der Kontraktion zu steigern.

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