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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-36867
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3686/


In silico Analysen, rekombinante Expression und Struktur-Funktionsanalysen humaner ADP-Ribosyl-X Hydrolasen (ARHs)

In silico analyses, recombinant expression and structure-function analyses of human ADP-ribosyl-X hydrolases (ARHs)

Kernstock, Stefan

Originalveröffentlichung: (2008) NIERE*, M.; KERNSTOCK*, S.; KOCH-NOLTE, F. et al (2008): Mol. Cell. Biol. 28: 814-824.MÜLLER-DIECKMANN*, C.; KERNSTOCK*, S.; LISUREK, M. et al (2006): Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103: 15026-31. KERNSTOCK, S.; KOCH-NOLTE, F.; MÜLLER-DIECKMANN, J. et al (2006): Acta Crystallogr. Sect. F 62: 224-7.
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SWD-Schlagwörter: ADP-Ribosylierung , NAD
Freie Schlagwörter (Deutsch): ADP-Ribosyl-X Hydrolasen , ARH, Poly-ADP-Ribose , 3D-Struktur , Lokalisation
Freie Schlagwörter (Englisch): ADP-ribosyl-X hydrolases , ARH , poly-ADP-Ribose , 3D-structure , localisation
Basisklassifikation: 35.74
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 10.06.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Die ADP-Ribosylierung ist eine reversible, kovalente Modifikation von Proteinen, die die Funktionsweise der Zielproteine verändern kann. Bei der Mono-ADP-Ribosylierung, die von bakteriellen Toxinen und bei Säugetieren von endogenen Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) katalysiert wird, wird ADP-Ribose von NAD auf ein Substrat übertragen. Poly-ADP-Ribose-Polymerasen (PARPs) katalysieren die Poly-ADP-Ribosylierung, bei der am Zielprotein ein verzweigtes Polymer aus ADP-Ribosegruppen erzeugt wird. ADP-Ribosyl-X Hydrolasen (ARHs) und Poly-ADP-Ribosylglykohydrolase (PARG) können die modifizierten Zielproteine de-ADP-ribosylieren. In Säugetier-Genomen finden sich drei Mitglieder der ARH-Familie (ARH1, ARH2 und ARH3). Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulare Charakterisierung humaner ARHs, mit einem Schwerpunkt auf ARH3.

Humanes ARH1 und ARH3 wurden kloniert und als rekombinante Proteine exprimiert. Rekombinantes ARH1 war fähig ADP-Ribosyl-Arginin zu spalten, während ARH3 keine Aktivität mit diesem Substrat zeigte; ARH3 war jedoch in der Lage, Poly-ADP-Ribose abzubauen. Die 3D-Struktur von ARH3 wurde in Kooperation mit Dr. Christoph Müller-Dieckmann (EMBL, Hamburg und ESRF, Grenoble, Frankreich) gelöst. ARH3 ist die erste publizierte ARH-Struktur und bildet den Archetyp einer neuen Proteinfaltungsfamilie. Das globuläre Protein besteht aus 18 alpha-Helices. Saure Aminosäuren an den Spitzen von vier zentralen Helices koordinieren zwei Magnesiumionen in einer Vertiefung. Durch docking-Experimente wurde die Bindung von ADP-Ribose und ADP-Ribosyl-ADP-Ribose in diesem putativen aktiven Zentrum modelliert. Zielgerichtete Mutagenesen der durch das docking-Experiment identifizierten Aminosäuren wurden durchgeführt und die enzymatische Aktivität der Mutanten wurde ermittelt. In Übereinstimmung mit der postulierten Funktion dieser Aminosäuren in der Bindung von ADP-Ribose zeigte sich bei vielen Mutanten ein Funktionsverlust. Die drei humanen ARH-Proteine wurden zur Untersuchung ihrer subzellulären Lokalisation als eGFP-markierte Fusionsproteine exprimiert. Während ARH1 in Cytosol und Zellkern nachweisbar war, zeigte ARH2 nur eine cytosolische Lokalisation. ARH3 war mitochondrial und nukleär lokalisiert. Unter Verwendung eines Zellkulturmodells mit intramitochondrial überexprimierter PARP1 konnte gezeigt werden, dass überexprimierte ARH3 auch in vivo Poly-ADP-Ribose abbaut und in der Matrix von Mitochondrien lokalisiert ist. Zusätzlich wurde durch Datenbankanalysen ARH4 entdeckt, ein neues ARH-Protein, das in Säugetieren fehlt, aber in Vögeln, Fröschen und Fischen vorkommt. Weitere ARH-Proteine wurden in Invertebraten, Archaeen, Bakterien und Viren identifiziert.

ARH-Proteine können zusammen mit ADP-Ribosyltransferasen und Poly-ADP-Ribosylpolymerasen als Komponenten endogener Regulationszyklen fungieren oder einen Schutzmechanismus vor ADP-ribosylierenden Toxinen darstellen. Die Strukturaufklärung der ARH3 und die durch docking-Experimente und zielgerichtete Mutagenese aufgezeigten Struktur-Funktionsbeziehungen bilden eine solide Grundlage für die weitere Charakterisierung von ARHs.
Kurzfassung auf Englisch: ADP-ribosylation is a reversible covalent protein modification that can change the function of target proteins. In mono-ADP-ribosylation, which is catalysed by bacterial toxins and endogenous mammalian mono-ADP-ribosyl transferases (ARTs), ADP-ribose is transferred from NAD onto a substrate. Poly-ADP-ribosyl polymerases (PARPs) catalyse poly-ADP-ribosylation, the formation of branched ADP-ribose polymers on target proteins. ADP-ribosyl-X hydrolases (ARHs) and poly-ADP-ribosyl glycohydrolase (PARG) can de-ADP-ribosylate modified target proteins. Three members of the ARH-family (ARH1, ARH2 and ARH3) can be found in mammalian genomes. The aim of this study was to molecularly characterise human ARHs, with a focus on ARH3.

Human ARH1 and ARH3 were cloned and expressed as recombinant proteins. ARH1 was capable of cleaving ADP-ribosylarginine, while ARH3 showed no activity with this substrate; however, ARH3 was capable of degrading poly-ADP-ribose. The 3D-structure of ARH3 was solved in cooperation with Dr. Christoph Müller-Dieckmann (EMBL, Hamburg and ESRF, Grenoble, France). ARH3 is the first ARH structure published and forms the prototype of a novel protein fold family. The globular protein consists of 18 alpha-helices. Acidic amino acids on the tips of four central helices coordinate two magnesium ions in a cavity. Docking experiments were performed to model the binding of ADP-ribose and ADP-ribosyl-ADP-ribose to the putative active site. Site-directed mutagenesis of amino acids identified by the docking experiments was performed and the enzymatic activity of the mutants was assessed. Many mutants showed a loss of function, consistent with the postulated role for these amino acids in ADP-ribose binding. The three human ARH-proteins were expressed as eGFP-tagged fusion proteins to assess their subcellular localisation. While ARH1 was detectable in cytosol and nucleus, ARH2 showed only cytosolic localisation, and ARH3 showed mitochondrial and nuclear localisation. In a cell culture model with intra-mitochondrially overexpressed PARP1, overexpressed ARH3 degraded poly-ADP-ribose generated within the mitochondrial matrix. Data base searches identified a new vertebrate ARH, designated ARH4, present in birds, fish and frogs but missing in mammals. Additional ARH-proteins were identified in invertebrates, archeae, bacteria, and viruses.

Together with ADP-ribosyl transferases and poly-ADP-ribosyl polymerases, ARH proteins can act as components of endogenous regulatory cycles or they can serve as a protective mechanism against ADP-ribosylating toxins. The crystal structure of ARH3, and the structure-function relationships pinpointed by site-directed mutagenesis and docking experiments provide a solid basis for further structural and functional characterisation of ARHs.

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