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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-37114
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3711/


Interagierende Proteinkinasen in Leishmania mexicana, die an der Regulation der Flagellenlänge beteiligt sind

Interacting Proteinkinases involved in the regulation of flagellar length in Leishmania mexicana

Scholz, Anne

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SWD-Schlagwörter: Leishmania mexicana , MAP-Kinase , Signaltransduktion , Parasitologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Flagellenlänge
Basisklassifikation: 42.36 , 35.74 42.
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 26.06.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Leishmanien sind parasitische Protozoen mit einem zweigeteilten Lebenszyklus. Die Promastigoten sind spindelförmig, tragen am vorderen Ende der Zelle ein Flagellum und leben im Darm von Sandmücken. Die Amastigoten hingegen leben im Phagolysosom von Makrophagen des Säugetierwirts. Sie sind oval und kleiner als die Promastigoten und das Flagellum ist soweit verkürzt, dass es nicht aus der Flagellartasche herausragt.
Mit LmxMKK wurde bereits 2003 ein MAP Kinase Kinase Homolog beschrieben, dessen Deletion zu einer deutlichen Verkürzung der Flagellen führt. In der vorliegenden Arbeit wurde das entsprechende Protein weiter charakterisiert. Mit LmxMPK3 konnte ein Substrat von LmxMKK identifiziert werden. Dabei handelt es sich um die erste nachgewiesene Interaktion einer MAP Kinase Kinase mit einer MAP Kinase in Trypanosomatiden, die auch in in vivo Versuchen bestätigt wurde. In in vitro Versuchen konnte eine Feedback-Phosphorylierung von LmxMKK durch LmxMPK3 beobachtet werden.
Auf der Suche nach weiteren Proteinkinasen, die an der Regulation der Flagellenlänge beteiligt sind, wurden LmxMPK9 und LmxPK4 genauer untersucht. Die Deletion der entsprechenden Gene führte in beiden Fällen zu einer leichten Verlängerung der Flagellen. In in vitro Kinase Aktivitätstests konnte jedoch keine Aktivierung von LmxMPK9 durch LmxPK4 nachgewiesen werden. Die Sequenzierung des Genoms von L. major erlaubte die Identifizierung der potentiellen MAP Kinasen LmxMPK13 und LmxMPK14. Die Deletion der beiden Gene führte auch hier zu Parasiten mit leicht verlängerten Flagellen. Tatsächlich konnte für LmxMPK13 eine Aktivierung durch die Coexpression mit LmxPK4 in E. coli beobachtet werden. LmxMPK14 hingegen interagiert nicht mit LmxPK4. In MS/MS-Analysen konnte bestätigt werden, dass LmxPK4 LmxMPK13 sowohl am Threonin- als auch am Tyrosinrest des TEY-Motivs phosphoryliert. Allerdings wurden zusätzlich auch Phosphorylierungen am N- und C Terminus von LmxMPK13 identifiziert, deren Bedeutung noch nicht geklärt ist.
Durch aktivierte LmxMPK13 wurden im Kinase Aktivitätstest mit Promastigotenlysaten Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht phosphoryliert. Diese konnten allerdings nicht direkt identifiziert werden. Das ungefähre Molekulargewicht und das Bedingung eines MAP Kinase Phosphorylierungsmotivs erlaubten die Eingrenzung auf zwei mögliche Substrate bei einer genomweiten Suche bei L. major. Eines davon, ein Homolog zu NOP10p, wurde im Kinase Aktivitätstest von der aktivierten LmxMPK13 phosphoryliert und kann somit als in vitro-Substrat von LmxMPK13 bezeichnet werden.
In dieser Arbeit gelang es das erste Mal Interaktionen zwischen MAP Kinase Kinasen und MAP Kinasen in L. mexicana nachzuweisen. Für LmxMKK und LmxMPK3 konnte diese Interaktion in vivo bestätigt werden. Für LmxPK4 und LmxMPK13 konnte zusätzlich mit LmxNOP10p noch ein potentielles Substrat einer MAP Kinase identifiziert werden.
Kurzfassung auf Englisch: The protozoan parasite Leishmania mexicana has a digenetic life cycle. It lives extracellularly as flagellated promastigotes in the midgut of the insect vector, the phlebotomine sandfly. Following infection of a mammal, the promastigotes are taken up by macrophages. Here they differentiate into smaller, “non-flagellated” amastigotes within the phagolysosomes.
LmxMKK, a mitogen-activated protein (MAP) kinase kinase of Leishmania mexicana, is required for growth of a full-length flagellum. In this work, LmxMPK3 could be identified as a substrate of LmxMKK. LmxMPK3 is phosphorylated and activated by LmxMKK in vitro. Furthermore LmxMKK is required for phosphorylation of LmxMPK3 in vivo. For the first time an interaction between a MAP kinase kinase and a MAP kinase has been demonstarted in Leishmania. Furthermore a feedback-phosphorylation of LmxMKK by LmxMPK3 was identified.
It had be shown before that LmxPK4 and LmxMPK9 are involved in flagellar shortening. Deletion mutants of these kinases display elongated flagella. However combined in vitro kinase assays revealed no activation of LmxMPK9 by LmxPK4. Once the sequencing project of the L. major genome was completed, the search for additional MAP kinases which could be involved in flagella length regulation led to the identification of two new MAP kinase genes, LmxMPK13 and LmxMPK14. The deletion of either of these genes in L. mexicana resulted in a significant elongation of the flagellum. LmxMPK13 was activated by co expression with LmxPK4 in Eschericha coli. A phosphorylation of the threonine and tyrosin residue of the TEY-motif of LmxMPK13 by LmxPK4 could be confirmed by tandem mass spectrometry analysis. Additional phosphorylations at the N- and C-terminus of LmxMPK13 were identified, but their function remains to be determined.
In in vitro kinase assays with lysates from promastigotes, activated LmxMPK13 phosphorylates several small proteins. As these proteins could not be identified directly by mass spectrometry analysis the genome of L. major was screened for proteins matching the criteria of low molecular weight and presence of a SP- or TP-motif. These are the typical phosphorylation sites of MAP kinases. One of them, LmxNOP10p, was indeed phosphorylated in protein kinase assays by the activated LmxMPK13. Therefore, LmxNOP10p is at least an in vitro-substrate of LmxMPK13.
To conclude, I have demonstrated an in vitro interaction between MAP kinase kinases and MAP kinases for LmxMKK and LmxMPK3, and LmxPK4 and LmxMPK13, respectively. Moreover, the interaction between LmxMKK and LmxMPK3 could be verified in vivo. Finally, I have identified LmxNOP10p as a potential substrate of LmxMPK13. Thus for the first time a signal transduction cascade with three elements was shown in Leishmania.

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