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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-37311
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3731/


Die duale Rolle von p53 in der zellulären Immortalisierung und der SV40 LT-vermittelten Transformation

Dual role of p53 in cellular Immortalization and SV40 LT-mediated Transformation

Hermannstädter, Andrea

Originalveröffentlichung: (2008) Krepulat, F., Löhler, J., Heinlein, C., Hermannstädter, A., Tolstonog, G.V. & Deppert, W. 2005. Epigenetic mechanisms affect mutant p53 transgene expression in WAP-mutp53 transgenic mice. Oncogene 24(29): 4645-59.
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SWD-Schlagwörter: Protein p53
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 15.07.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Die Inaktivierung des Tumorsuppressors p53 ist ein wesentliches Ereignis in der Immortalisierung von Zellen und ein entscheidender Schritt in Richtung Transformation bzw. Tumorgenese. In vielen humanen Tumoren liegt p53 mutiert und damit inaktiv vor, wobei im Fall von p53 hauptsächlich missense-Punktmutationen auftreten. Da diese zum Austausch von nur einer AS führen, kommt es zur Expression eines Volle-Länge mutiertem p53 (mutp53), welches hauptsächlich im Nukleus lokalisiert. mutp53 verliert auf der einen Seite die tumorsupprimierenden Funktionen von Wildtyp p53 (wtp53) (loss of function). Auf der anderen Seite weisen verschiedene Studien darauf hin, dass mutp53 neue, onkogene Aktivitäten hinzugewinnt (gain of function). Auch nach Infektion von Zellen mit DNA-Viren müssen negative Zellzyklusregulatoren der Wirtszelle wie p53 ausgeschaltet werden, damit eine von den Viren bevorzugte S-Phasenprogression stattfinden kann. Im Allgemeinen wird p53 durch virale Onkogene gebunden und anschließend degradiert. Auch bei einer Infektion mit SV40 geht man davon aus, dass p53 durch eine Komplexbildung mit SV40 LT transkriptionell inaktiviert wird. Auffällig dabei ist, dass LT im Gegensatz zu anderen viralen Onkogenen zu einer metabolischen Stabilisierung und nukleärer Lokalisation von p53 führt, die mit der Akkumulation von mutp53 im Nukleus vergleichbar ist.
Vor dem Hintergrund einer möglichen aktiven Funktion des LT-p53 Komplexes in der SV40-induzierten zellulären Transformation war es Ziel dieser Arbeit, die positive Rolle von p53 in der Transformation weiter zu charakterisieren. Der „helfenden“ Rolle von p53 in der SV40 LT-Transformation wurde die negative Rolle von p53 in der spontanen Immortalisierung gegenüber gestellt.
Primäre und etablierte murine Balb/c Mausembryofibroblasten (MEF) mit wtp53 und p53-null Hintergrund bildeten das experimentelle System zur Analyse dieser dualen Rolle von p53. Während der Kultivierung primärer Balb/c wtp53 MEF unter Standardbedingungen (21% O2) kommt es nach einem Wachstumsarrest zur spontanen Immortalisierung, die mit einem Auftreten von missense-Punktmutationen im p53-Gen verbunden ist. Durch Kultivierung der MEF bei physiologischeren Sauerstoff-Bedingungen (5% O2) kann das Auftreten einer p53-Punktmutation nicht verhindert werden. Das nukleäre, stabile Volle-Länge mutp53 scheint dabei den Zellen (MEF5 und MEF20) einen Proliferationsvorteil zu verschaffen, ein Hinweis auf einen Funktionsgewinn (gain of function). Die schützende Rolle von wtp53 in der Wachstumskontrolle durch Einleitung eines Wachstumsarrests muss demnach bei der Immortalisierung von Zellen überwunden werden. Bei der Untersuchung des Einflusses von wtp53 in der SV40 LT-induzierten Transformation von Balb/c Zelllinien konnte dagegen eine unterstützende Rolle von wtp53 gezeigt werden. So konnte in klassischen Transformationsversuchen bei der Untersuchung des Phänotyps stabil SV40 LT-exprimierender wtp53 (3T3), p53-null (10-1) und deltaNp53 Balb/c Fibroblasten eine positive Funktion von stabilisiertem, nukleären wtp53 im LT-p53-Komplex gezeigt werden. Die mit der verminderten Transformationseffizienz von p53-null Zellen vergleichbaren Ergebnisse der N-terminal trunkierten p53-Mutante waren ein Hinweis auf eine p53-aminoterminal vermittelte Helferfunktion im Komplex mit LT. In der LT-vermittelten Transformation ist die Komplexierung von wtp53 durch LT daher nicht mit einer p53-null Situation vergleichbar.
Die Histon-Acetyltransferasen und Co-Aktivatoren p300/CBP binden an den N-Terminus von p53 und bilden über p53 mit LT einen Multiproteinkomplex. In dem hier untersuchten Zellsystem konnte eine p300/CBP- und p53-abhängige Acetylierung von LT im C-terminalen Ende bestätigt werden. Diese Acetylierung wird über den p53-N-Terminus vermittelt, da in Zellen, die die ΔNp53-Mutante exprimieren, kein acetyliertes LT detektiert werden konnte. Die Acetylierung von LT scheint aber nur einen indirekten Beitrag zur Transformation zu leisten, da bereits gezeigt werden konnte, dass eine Deletion der Aminosäuren des C-terminalen Endes von LT die Transformationskapazität nicht vermindert. Weitere Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine durch LT induzierte Reaktivierung teilweise reprimierter Gene. Dies legt die Vermutung nahe, dass LT durch Rekrutierung von p53 und p300/CBP deren Funktionen im Chromatin Remodeling für die LT-induzierte Zelltransformation ausnutzt und zu einem erhöhten Ausmaß der Transformation führt.

Die hier vorgelegten Untersuchungen zeigen, dass p53 je nach zellulärem Kontext eine duale Rolle einnehmen kann. Zum einen agiert es als schützendes Tumorsuppressorprotein und negativer Zellzyklusregulator, der in der spontanen Immortalisierung eliminiert werden muss, zum anderen kann p53 Funktionen auf LT übertragen, die essentiell für dessen transformierende und onkogene Eigenschaften sind.
Kurzfassung auf Englisch: A major event in cellular immortalisation and a crucial step towards transformation and tumorigenesis respectively is the inactivation of the tumor suppressor protein p53. The p53 gene is mutated and thus inactivated in many human cancers. A particularity of p53 mutations is a preference for missense point mutations. Given the fact that this leads to a substitution of only one amino acid, a full length mutant p53 (mutp53) is expressed, which localises primarily to the nucleus. On the one hand mutp53 loses the tumor suppressive functions of wtp53 (loss of function). On the other hand different studies indicate an acquisition of new oncogenic activities (gain of function) of mutp53. Following infection of cells with DNA tumor viruses negative cell cycle regulators like p53 have to be eliminated to allow progression of the cells into S-phase, which is required for viral replication. In general, p53 is bound and degraded by viral oncogene products. Upon SV40 infection, p53 is transcriptionally inactivated by complex formation with SV40 LT. Strikingly, in contrast to p53’s interaction with other viral oncogene products, this leads to metabolic stabilisation and nuclear accumulation of p53, comparable to the accumulation of mutp53 in the nucleus.
Based on the assumption that the LT-p53 complex potentially executes an active function in SV40-induced cellular transformation, the aim of this study was to further characterize the positive role of p53 in the transformation process.
As an experimental system for the analysis of the dual role of p53 primary and established murine Balb/c mouse embryonic fibroblasts (MEF) with a wtp53 and p53-null background were chosen. During cultivation of primary Balb/c wtp53 MEF under standard conditions a proliferation block occurs that was bypassed by spontaneous immortalization associated with the appearance of p53 missense point mutations. p53 point mutations occurred also in MEF cultured under conditions of low oxygen (5% O2). Stabilised nuclear full-length mutp53 appeared to provide the cells (MEF5 and MEF20) with a proliferation advantage, providing a hint for a gain of function. Thus overcoming the protective role of wtp53 in growth control seems to be a prerequisite for cellular immortalisation. In contrast, analyzing the influence of wtp53 on SV40 LT-induced transformation of Balb/c cell lines revealed a supportive role of wtp53. Classical transformation assays with wtp53 (3T3), p53-null (10-1) and deltaNp53 Balb/c fibroblasts stably expressing SV40 LT demonstrated a positive function of stabilised nuclear wtp53 in the LT-p53 complex. The reduced transformation efficiency seen in p53-null cells, which is comparable to the results obtained with cells expressing an N-terminally truncated p53 variant, indicates a helper function of p53 in complex with LT which is mediated by the amino terminus of p53. During LT-induced transformation complex formation of LT with p53 is not equivalent to a p53-null situation.
The histone acetyltransferases and co-activators p300 and CBP bind to the N-terminus of p53 and form a multiprotein complex via p53 with SV40 LT. In the cell system analyzed here, the p300/CBP- and p53-dependent acetylation of LT in its C-terminal end could be confirmed. This acetylation requires the amino terminus of p53, as in cells expressing the deltaNp53 variant no aceytlated LT could be detected. However, acetylation of LT seems to contribute only indirectly to the transformation process. It was shown that a deletion of the very last amino acids at the C-terminus of LT did not diminish its transformation capacity. Further analysis in the present study revealed a LT-mediated reactivation of partially repressed genes. This is evidence to suggest that LT utilises the chromatin remodeling functions of p53 and p300/CBP for LT-induced cell transformation.
The presented studies showed that p53 exerts a dual role in SV40 transformation, depending on the cellular context. On the one hand p53 acts as a protective tumor suppressor protein and negative cell cycle regulator, which has to be eliminated during spontaneous immortalisation; on the other hand p53 can transmit functions to LT, which are essential for its transforming and oncogenic properties.

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