Beschreibung eines neuen Proteins und seiner Interaktion mit dem 300kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor

Abstract

1. Ein Antiserum gegen die C-terminale Domäne von p66 wurde in Western-Blot-Analysen, in der Immunpräzipitation und in Immunofluoreszenz-Analysen untersucht. In Western-Blot-Analysen aus Homogenaten verschiedener humaner epithelialer Zelllinien war eine Expression von p66 nur in HeLa-Zellen zu detektieren. In allen untersuchten Zelllinien war eine starke Expression eines homologen 93 kDa-Proteins nachweisbar. In metabolisch markierten, p66 transient-überexprimierenden BHK-Zellen wurde mit dem Antiserum spezifisch ein 66 kDa Protein präzipitiert. Diese Befunde belegen, dass p66 in BHK-Zellen hauptsächlich vom M1 Startcodon ausgehend translatiert wird.

2. Nach in vitro Translation der p66 cDNA in einem Reticulozytenlysat wurden zwei Banden von 66 kDa und 60 kDa detektiert, die wahrscheinlich durch Translation von zwei Startcodons (M1, M28) resultieren.

3. Nach Ultrazentrifugation von postnukleären Überständen wurde p66 sowohl in der zytosolischen Fraktion (25%) als auch in einer Gesamt-Membranfraktion (75%) detektiert. Aufgrund der fehlenden Transmembrandomänen und fehlender gpi-Anker-Konsensussequenz ist p66 wahrscheinlich kein integrales Membranprotein, sondern mit Membranen assoziiert.

4. Die beiden Konsensussequenzen für N-verbundene Glykosylierung Asn345GS und Asn410RT von p66 werden in BHK-Zellen in vivo nicht benutzt.

5. Es wurden keine phosphorylierten p66-Formen detektiert, so dass die Assoziation/ Dissoziation von p66 an Membranen wahrscheinlich nicht durch Phosphorylierung/ Dephosphorylierung reguliert wird.

6. In Immunfluoreszenzanalysen an transient transfizierten CHO-Zellen kolokalisiert ein p66-Myc Fusionsprotein im steady state mit dem Kernkompartiment-Marker DAPI.

7. Pulse-Chase Analysen zeigten, dass die Überexpression von p66 die MPR300 abhängige Sortierung von neusynthetisiertem Cathepsin D im Golgi-Apparat verbessert. Gleichzeitig war die Prozessierung von Cathepsin D nicht verändert.

8. In p66-überexprimierenden BHK-Zellen war die MPR300-abhängige Endozytose von Arylsulfatase B im Vergleich zu Kontrollzellen statistisch nicht signifikant um etwa 13% erhöht. 9. In Immunfluoreszenzanalysen wurde nach transienter Expression von p66 keine Veränderung der intrazellulären Verteilung der MPR300-Rezeptoren im Vergleich zu Kontrollzellen detektiert.

10. Zusammenfassend lassen die beschriebenen Beobachtungen die Vermutung zu, dass p66 möglicherweise den anterograden Transport des MPR300 verstärkt.