"ASS-Resistenz" bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung

Abstract

Niedrig dosierte Acetylsalicylsäure (ASS) ist das Mittel der Wahl in der Sekundärprophylaxe der koronaren Herzerkrankung (KHK). Trotz ASS-Therapie erleidet eine beachtliche Anzahl von Patienten erneut kardiovaskuläre Ereignisse. Daher stellt sich die Frage, ob diese Ereignisse zum Teil das Resultat einer fehlenden oder verminderten Wirkung von ASS („ASS-Resistenz“, AR) sind. Zu dem Phänomen der AR können gegenwärtig zahlreiche Fragen nicht ausreichend beantwortet werden: Kommt der AR eine klinische Bedeutung zu? Wie häufig tritt sie auf? Welche Methode zur AR-Bestimmung liefert die zuverlässigsten Ergebnisse? Welche Ursachen und Mechanismen liegen einer AR zugrunde? Gibt es therapeutische Alternativen zur Überwindung einer AR? Ziel der vorliegenden Arbeit war, KHK-Patienten mit einer AR zu identifizieren, zu charakterisieren und verschiedene Hypothesen zu AR-Mechanismen zu überprüfen. Es sollte untersucht werden, ob eine verstärkte COX-2-Expression in Thrombozyten, eine extrathrombozytäre TxA2-Synthese, eine vermehrte Bildung von Isoprostanen oder genetische Variationen des thrombozytären P2Y12-Rezeptors zur AR beitragen. Es wurden 130 stabile KHK-Patienten, die mit 100mg ASS/d behandelt wurden, in die Studie eingeschlossen. Die Bestimmung der Thrombozytenaggregation erfolgte turbidimetrisch in plättchenreichem Plasma mit Kollagen (0,5, 1, 2, 5 und 10mg/l), AA (1mM) und ADP (2µM) als Agonisten. Außerdem wurde der Einfluss von 100µM ASS und 10µM Rofecoxib in vitro auf die Aggregation untersucht. Die Kollagen-induzierte TxB2-Bildung wurde mittels EIA bestimmt. Die ASS-Metabolite wurden im Urin mittels HPLC quantifiziert. Es wurden COX-1-Vollblut-Aktivitätsassays durchgeführt sowie Versuche zur Ermittlung der COX-2-Vollblut-Aktivität sowohl hinsichtlich der PGE2- als auch TxB2-Bildung. Darüberhinaus wurde die Exkretion von 2,3-dn-TxB2 und 2,3-dn-6-keto-PGF1a mittels GC-tandem MS analysiert. Anhand von Western Blots erfolgte die Quantifizierung der thrombozytären COX-2. Mittels IAC und GC-MS wurde die 8-iso-PGF2a-Exkretion bestimmt. Die P2Y12-Polymorphismen (52G>T und 34C>T) wurden mit Hilfe der PCR-RFLP-Analyse untersucht. Es wurde hinsichtlich der max. Kollagen-induzierten Aggregation eine erhebliche interindividuelle Variabilität festgestellt. Die TxA2-Bildung war bei allen bis auf 4 Patienten komplett supprimiert. Lediglich bei diesen 4 Patienten konnte durch den ASS-Zusatz in vitro eine Reduktion der Aggregation (um 50%) erzielt werden, einhergehend mit einer nahezu 100%igen Hemmung der TxA2-Synthese. Bei einem dieser Patienten wurde die verminderte ASS-Wirkung durch eine ASS-Ibuprofen-Interaktion hervorgerufen, bei den weiteren 3 Patienten durch pharmakokinetische Besonderheiten oder eine Non-Compliance. Von den verbliebenen 126 Patienten wurden die Patienten, die der obersten Terzile mit der höchsten Aggregation angehörten, als ASS-Low-Responder eingestuft (n=42). Die Thrombozyten der Low-Responder sprachen bereits auf geringste Kollagen-Konzentrationen an (EC50=0,19mg/l), während vergleichbare Konzentrationen im PRP der Responder keine Aggregation auslösen konnten (p<0,0001). Zusätzlich zeigten die Low-Responder eine verstärkte ADP-induzierte (p<0,0001) sowie AA-induzierte Aggregation (p<0,0001), obwohl bei letzterer kein Wert über 20% lag. Die Low-Responder waren signifikant älter (p=0,0004) und häufiger von einer Hypercholesterinämie betroffen (p=0,0334). Patienten, die in den letzten 3 Monaten gegen Pneumokokken, Hepatitis A oder Tetanus/Diphtherie geimpft worden waren, zeigten eine höhere Aggregation als die kurz zuvor nicht geimpften Patienten (p=0,014). Responder und Low-Responder unterschieden sich zwar nicht in der thrombozytären COX-2-Expression, dennoch ließ sich die Aggregation im Gegensatz zur TxA2-Synthese in Abhängigkeit vom thrombozytären COX-2-Gehalt etwas durch Rofecoxib reduzieren (p=0,0169). Je höher der CRP-Wert lag, desto höher war die COX-2(74kDa)-Expression in den Thrombozyten (p=0,0297). Die Low-Responder zeigten eine verstärkte 8-iso-PGF2a-Exkretion (p=0,0009). Die P2Y12-Polymorphismen standen in keiner Beziehung zur AR. Die retrospektive Analyse ergab, dass Low-Responder, die vor Beginn der ASS-Therapie bereits einen MI erlitten hatten, signifikant häufiger von einem Reinfarkt unter ASS betroffen waren als Responder (p=0,0398). Bei zahlreichen ASS-behandelten KHK-Patienten ist die Aggregation trotz komplett inhibierter TxA2-Synthese nur unzureichend gehemmt. Insbesondere scheinen Anzeichen einer chronisch systemischen Entzündung und ein gestörtes oxidatives/antioxidatives Gleichgewicht zur AR beizutragen. Möglicherweise spielt die COX-unabhängige Bildung von proaggregatorisch wirksamen Isoprostanen eine zentrale Rolle. Diese Patienten sind vermutlich einem erhöhten Risiko für wiederkehrende kardiovaskuläre Ereignisse ausgesetzt. Die zusätzliche Gabe von Clopidogrel oder TxA2-Rezeptor-Antagonisten könnten vielversprechende Ansätze zur Überwindung einer AR sein.

Low-dose aspirin is the most commonly used antiplatelet drug for secondary prevention in patients with coronary artery disease (CAD). Despite aspirin therapy, a substantial number of patients experience recurrent cardiovascular events. Thus, the question arises whether these events are in part due to a lacking or diminished response to aspirin (“aspirin resistance”, AR). Currently, numerous questions regarding the phenomenon of AR cannot be answered sufficiently: Is there a relation between AR and clinical outcomes? How prevalent is AR? Which laboratory method gives the most reliable results? Which are the causes and mechanisms underlying AR? Are there therapeutic opportunities to overcome AR? The aim of the present work was to identify and to characterize CAD patients with AR and to test several hypothetical mechanisms of AR. The objective was to investigate whether increased platelet COX-2 expression, extraplatelet TxA2 biosynthesis, isoprostane formation or genetic variations of the platelet receptor P2Y12 contribute to AR. A total of 130 stable CAD patients taking 100mg aspirin/day were included in the study. Platelet aggregation was studied in platelet-rich plasma by turbidimetry. Platelets were stimulated either by collagen (0.5, 1, 2, 5 and 10mg/L), AA (1mM) or ADP (2µM). Furthermore, aggregation was determined in samples treated with 100µM aspirin or 10µM rofecoxib in vitro. Collagen-induced TxA2 formation was measured by EIA. The aspirin metabolites were quantified in urine by HPLC. In whole blood, COX-1 and COX-2 activity assays were performed; in this, the contribution of COX-2 activity to both TxA2 and PGE2 synthesis was studied. In addition, excretion of 2,3-dn-TxB2 and 2,3-dn-6-keto-PGF1a was analyzed by GC-tandem MS. Western Blotting was carried out to quantify platelet COX-2 protein expression. Determination of excretion of 8-iso-PGF2a was performed by IAC and GC-MS. P2Y12 polymorphisms (52G>T and 34C>T) were detected by PCR-RFLP analysis. Despite regular aspirin treatment, a wide interindividual variability of maximal ex vivo aggregation responses to collagen was noted. TxA2 formation was completely inhibited in all but 4 patients. Only in these 4 patients, a reduction of aggregation (about 50%) was achieved by adding aspirin in vitro, accompanied by a nearly 100% inhibition of TxA2 synthesis. In one of these patients, AR was caused by an interaction between aspirin and ibuprofen. In the other 3 patients, reduced aspirin response was due to pharmacokinetic mechanisms or noncompliance. Among the remaining 126 patients, those patients were defined to be aspirin low-responders who belong to the highest tertile of residual platelet activity (n=42). Platelets of low-responders formed aggregates when stimulated by very low collagen concentrations (EC50=0.19mg/L), whereas comparable concentrations did not evoke aggregation in PRP of responders (p<0.0001). In addition, low-responders had significantly higher ADP-induced (p<0.0001) and AA-induced aggregation (p<0.0001), although the latter did not show any value above 20%. Low-responders were significantly older (p=0.0004) and more often hypercholesterolemic (p=0.0334). Patients who had received vaccination against pneumococcus, hepatitis A, or tetanus/diphtheria within 3 months preceding the study had a significantly higher residual platelet activity than those who had received no immunization (p=0.0140). There was no significant difference in the levels of COX-2 protein expression between responders and low-responders; however, depending on platelet COX-2 protein concentration, aggregation in contrast to TxA2 formation was somewhat reduced by rofecoxib (p=0.0169). C-reactive protein levels correlated positively with COX-2(74kDa) expression in platelets (p=0.0297). Low-responders showed a significantly higher excretion of 8-iso-PGF2a compared to responders (p=0.0009). The P2Y12 polymorphisms did not contribute to AR. A retrospective analysis revealed that low-responders who had experienced their first myocardial infarction before the first prescription of aspirin were significantly more affected by a reinfarction during chronic aspirin treatment than responders (p=0.0398). Despite complete inhibition of the TxA2 amplification pathway, a considerable number of CAD patients taking low dose aspirin for cardiovascular protection showed an inadequate inhibition of platelet aggregation. Signs of chronic systemic inflammation and an altered oxidant/antioxidant balance seem to contribute to AR. The increased platelet reactivity may be mediated by isoprostanes which are released by a non-enzymatic, free radical-mediated mechanism, and activate platelets via TxA2 receptor stimulation. These “aspirin resistant” patients are likely to be at increased risk of recurrent cardiovascular events compared with “aspirin sensitive” patients. The addition of platelet inhibitors like clopidogrel or TxA2 receptor antagonists may be helpful to overcome AR.