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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38709
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3870/


Strukturdeterminanten für das Schaltverhalten des humanen spannungsgesteuerten Kaliumkanals Kv4.2

Barghaan, Jan

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SWD-Schlagwörter: Ionenkanal , Spannungskontrollierter Ionenkanal , Kaliumkanal , Inaktivierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): Geschlossen-Kanal-Inaktivierung
Freie Schlagwörter (Englisch): closed-state-inactivation
Basisklassifikation: 42.12
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bähring, Robert (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 06.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Kv4.2 Kaliumkanäle sind spannungsgesteuert und zeichnen sich durch eine schnelle Aktivierung und Inaktivierung aus. In Neuronen bilden ternäre Komplexe aus Kv4.2 α-Untereinheiten zusammen mit den akzessorischen beta-Untereinheiten KChIP (Kv-Kanal interagierendes Protein) und DPP (Dipeptidyl-Aminopeptidase-ähnliches Protein) das molekulare Korrelat des unterschwellig aktivierten, somatodendritischen A-Typ Stroms (ISA), der entscheidend an der Kontrolle dendritischer Erregbarkeit beteiligt ist. Die besondere Eigenschaft der Kv4 Kanäle schon bei Potenzialen negativ der Aktivierungsschwelle in einen refraktären, inaktivierten Zustand überzugehen, die Geschlossen-Kanal-Inaktivierung, spielt dabei eine wichtige Rolle. Im Gegensatz zur gut untersuchten N-Typ Inaktivierung ist der Mechanismus der Kv4.2-Geschlossen-Kanal-Inaktivierung bisher weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Mechanismus der Kv4.2 Geschlossen-Kanal-Inaktivierung vorgeschlagen, der strukturell auf einer Entkopplung von aktiviertem Spannungssensor und S6-Gate beruht.
Durch einen Alanin-Mutagenese-Scan im Bereich der Kopplungsstelle von Spannungssensor und S6-Gate mit nachfolgender thermodynamischer Analyse der Geschlossen-Kanal-Inaktivierung einzelner Kv4.2-Mutanten konnte die Relevanz der Kopplungsstelle von Spannungssensor und S6-Gate für die Geschlossen-Kanal-Inaktivierung herausgestellt werden. Für alle Kv4.2-Mutanten wurde die Affinität für den geschlossen-inaktivierten Zustand berechnet und so die Auswirkungen der Mutationen quantifiziert. Basierend auf diesen Parametern wurde eine Double-Mutant-Cycle-Analyse durchgeführt, die spezifische Aminosäuren im Bereich des S4-S5-Linkers und im S6-Segment als Interaktionspartner identifizierte. Insbesondere für die Aminosäuren E323 im S4-S5-Linker und V404 im S6-Segment ergab die Double-Mutant-Cycle-Analyse einen hohen Grad der Kopplung. Dieses Ergebnis konnte durch spezifische Redox-Modulation der korrespondierenden Cystein-Doppelmutante mit einem unabhängigen experimentellen Ansatz bestätigt werden.
Durch die Generierung von chimären Kanälen aus Shaker und Kv4.2 konnte gezeigt werden, dass die Kv4.2 Kopplungsstelle von Spannungssensor und Gate im Shaker-Kanal eine Inaktivierung vermittelt, während umgekehrt die Shaker-Kopplungsstelle die Geschlossen-Kanal-Inaktivierung im Kv4.2-Kanal hemmt.
Kurzfassung auf Englisch: Kv4.2 potassium channels are voltage-dependent and display rapid activation and inactivation. In neurons ternary complexes of Kv4.2 α-subunits and the accessory beta-subunits KChIP (Kv-channel interacting protein) and DPP (dipeptidyl aminopeptidase-like protein) are the molecular correlate of the subthreshold activating, somatodendritic A-type current (ISA), which is known to be involved in controlling dendritic excitability. A characteristic feature of Kv4 channel gating is the onset of inactivation at potentials negative to the activation threshold. This inactivation is termed closed-state inactivation, because at these potentials the channels enter a refractory, inactivated state directly from closed-states before reaching the open-state.
In contrast to the well studied mechanism of N-type inactivation the mechanism of Kv4.2 closed-state inactivation is poorly understood. In this study a novel model for the mechanism of Kv4.2 closed-state inactivation was tested, which is structurally based on uncoupling of the activated voltage sensor and the S6-Gate. The relevance of the coupling interface between voltage-sensor and S6-gate was demonstrated by means of Alanin scanning mutagenesis followed by detailed thermodynamic analysis of closed-state inactivation for the respective Kv4.2 mutants. For all functional Kv4.2 mutants affinities for the closed-inactivated state were calculated to quantify the mutation induced effects. Based on these parameters a double-mutant-cycle analysis was conducted, which identified specific interaction between amino acids in the S4-S5 linker region and the S6 region of the scan. Particularly for the glutamate at position 323 in the S4-S5 linker region and the valine at position 404 in S6 the double-mutant-cycle analysis revealed a high degree of interaction. Specific redox modulation of the corresponding double-cysteine mutant confirmed this result by an independent experimental approach.
Generation of chimeric channels consisting of Shaker and Kv4.2 showed that the Kv4.2 interface, which couples voltage-sensor and gate is able to mediate inactivation in a non-inactivating Shaker channel, while the Shaker interface inhibits closed-state inactivation in Kv4.2 channels.

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