FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38788
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3878/


Über die Effekte der adenoviralen Überexpression von Protein Phosphatase Inhibitor-1 in Herzmuskelzellen.

About the effects of adenoviral overexpression of protein phosphatase inhibitor-1 in cardiac myocytes.

Ditz, Diana

Originalveröffentlichung: (2008) El-Armouche A, Rau T, Zolk O, Ditz D, Pamminger T, Zimmermann W-H, Jäckel E, Harding SE, Boknik P, Neumann J, Eschenhagen T. Evidence for protein phosphatase inhibitor-1 playing an amplifier role in β-adrenergic signaling. FASEB J 2003; 17:437-439.
pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (2.438 KB) 


SWD-Schlagwörter: Herzmuskelzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch): Protein Phosphatase Inhibitor-1 , adenovirale Überexpression , beta-adrenerge Signaltransduktion , Kontraktilität , Phospholambanphosphorylierung
Freie Schlagwörter (Englisch): Phosphatase inhibitor-1 , adenoviral overexpression , beta-adrenergic signalling , contractility , phospholambanphosphorylation
Basisklassifikation: 44.38 , 44.47 , 44.85
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.09.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 05.12.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Hintergrund: Die funktionelle Anpassung der Herzleistung an den peripheren Bedarf wird im Wesentlichen durch den Sympathikus gewährleistet. Die sympathischen Transmitter Noradrenalin und Adrenalin (Katecholamine) aktivieren über beta-Adrenozeptoren intrazelluläre Signalkaskaden, die über Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen zu Funktionsveränderungen von regulatorischen Phosphoproteinen führen und damit die verschiedenen physiologischen Effekte begründen. Der Phosphorylierungszustand wichtiger Phosphoproteine kann über eine Aktivierung der entsprechenden Kinase oder eine Hemmung der entsprechenden Phosphatase erhöht werden. Letztere werden vornehmlich durch inhibitorische Proteine reguliert. Der Proteinphosphatase Inhibitor-1 (PPI-1) ist ein solches Phosphatase-Regulatorprotein und hemmt ausschließlich nach Phosphorylierung durch die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) sehr potent die kardial vorherrschenden Typ 1 Proteinphosphatasen (PP1). PPI-1 ist aus Herzkreislauf-physiologischer Sicht besonders interessant, da über dieses Protein Katecholamine am Herzen nicht nur über die bekannte Aktivitätssteigerung der PKA, sondern auch durch eine Hemmung der PP1 wirken könnten. PPI-1 könnte so ein positives Rückkopplungselement der beta-adrenergen Signalkaskade darstellen.
Zu Beginn dieser Arbeit waren weder die prinzipielle Rolle noch die Auswirkungen einer veränderten Expression von PPI 1 im Herzen bekannt. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die Überexpression von PPI-1 in Herzmuskelzellen tatsächlich zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber Katecholaminen führt und ob dies mit einer gesteigerten Phosphorylierung von kardialen Regulatorproteinen einhergeht.
Methoden: Als Modelle dienten der adenoviraler Gentransfer von Wildtyp PPI-1 mit und ohne bicistronischer EGFP-Koexpression (AdEGFP/PPI-1 und AdPPI-1) in (1) Monolayerkulturen von Kardiomyozyten neonataler Ratten (KMNR) für die Untersuchung von biochemischen Parametern (radioaktive Phosphatase-Enzymassays mit und ohne rekombinantem PPI-1 Protein, cAMP-Immunoassays, Zellimmunfluoreszenzfärbungen und Western Blots mit phosphospezifischen Antikörpern) und/oder (2) rekonstituiertem Herzmuskelgewebe aus KMNR (engineered heart tissue, EHT) für die Untersuchung der Kontraktionsparameter (Kontraktionskraft, Kontraktionskinetik). Als Kontrollen dienten (1) nicht-infizierte, (2) „nur-EGFP“ (AdEGFP) und/oder (3) „nur LacZ“ (AdLacZ) überexprimierende KMNR bzw. EHTs. Während AdEGFP/PPI-1, AdEGFP und AdLacZ bereits generiert und hier nur vermehrt und aufgereinigt wurden, wurde AdPPI-1 im Rahmen dieser Arbeit neu generiert.
Ergebnisse: Zunächst wurde der adenovirale Gentransfer in EHTs mit Hilfe der EGFP-Epifluoreszenz und der konfokalen Lasermikroskopie erstmalig etabliert. Als optimale Bedingungen erwies sich die Infektion an Tag 10-12 nach Herstellung der EHTs mit einer Viruspartikelzahl/Zelle von 50-100 für 24-48 h. In diesem Modell wurden folgende Hauptergebnisse erzielt:
Die Virusinfektion und/oder die EGFP-Überexpression per se zeigten einen deutlichen kontraktilitätsmindernden Effekt (-33 bis -48%) im Vergleich zu nicht-infizierten EHTs.
PPI-1 überexprimierende EHTs (AdEGFP/PPI-1) zeigten eine gesteigerte Sensitivität gegenüber dem positiv inotropen Effekt von Isoprenalin (3,1-fach vs. uninfizierte Kontrollen und 1,5-fach vs. AdEGFP-infizierte EHTs).
In dem Modell der klassischen Monolayerkultur wurden folgende Hauptergebnisse erzielt:
PPI-1 überexprimierende KMNR zeigten eine erhöhte PKA-vermittelte Phosphorylierung von Phospholamban, einem zentralen Regulator des Calciumstoffwechsels in Herzmuskelzellen, an Serin16 verglichen mit uninfizierten (+15 bzw. +77%) und kontroll-infizierten (+3 bzw. +38%) KMNR.
Der cAMP-erhöhende Effekt von Isoprenalin war in PPI-1 überexprimierenden KMNR niedriger als in uninfizierten (-22%) und kontroll-infizierten (-26%) KMNR.
Schlussfolgerungen: Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass (1) EGFP-kodierende adenovirale Konstrukte per se die kontraktile Funktion in Herzmuskelzellen stark beeinträchtigen und (2) die Überexpression von PPI-1 zu einer Supersensitivität gegenüber Katecholaminen führt und dies eine vermehrte Phosphorylierung von Phospholamban einschließt. Die niedrigere cAMP-Konzentration nach PPI-1 Überexpression deutet auf kompensatorische Mechanismen oberhalb der PKA hin. Diese Daten stellen ein starkes Argument für die Hypothese dar, dass PPI-1 in der Tat ein positives Rückkopplungselement des beta-adrenergen Signalwegs im Herzen darstellt.
Kurzfassung auf Englisch: Introduction: The adaption of cardiac output to peripheral needs is mainly mediated by the sympathetic nervous system. The catecholamins norepinephrin and epinephrine are activating an intracellular singalling cascade by beta-adrenoceptors and thus leading to a different activation state of various regulatory proteins by changing their phosphorylation state. Through activation of specific kinases or inhibition of specific phosphatases an higher phosphorylation state of manny important phosphoproteins is obtained. The phosphatases are mainly regulated by inhibitory proteins and the protein phosphatase inhibitor-1 (PPI-1) is one of these proteins which is only after activation by cAMP dependent proteinkinase (PKA) inhibiting protein phosphatase type 1 (PP1). Due to PPI-1 catecholamines can not only act by an increase of PKA activity but also by an inhibition of PP1 which makes PPI-1 to a very interessting protein in cardiac signalling. PPI-1 could be a positive amplifier of beta-adrenergic signalling. At the beginning of this investigations little has been known about the effects of PPI-1 overexpression in the heart. The aims of this investigatons was to find out if the overexression of PPI-1 in cardiac myocytes is increasing catecholamine-sensitivity and if it is attended by an increase of phosphorylation of cardiac regulatory proteins.
Methods: PPI-1 overexpression was conducted by an adenoviral gentransfer of wildtyp PPI-1 with or without bicistronic EGFP coexpression (AdEGFP/PPI-1 and AdPPI-1) in (1) monolayer culture of cardiac myocytes of neonatal rats (KMNR) for the investigation of biochemical parameters (radioactive phsphatase-enzymeassay with or without recombinant PPI-1, cAMP immunoassay, immunofluorescent cell staining and immunoblots with phosphospecific antibodies) and/or (2) engineered heart tissue (EHT) for investigations of contraction parmeters (force of contraction, cinetics of contraction). As controlls served (1) not-infected, (2) only EGFP (AdEGFP) and/or only LacZ (AdLacZ) overexpressing KMNRs or EHTs. AdEGFP/PPI-1, AdEGFP and AdLacZ have been already available, AdPPI-1 has been cloned newly for this investigations.
Results: First the adenoviral gentransfer in EHTs has been established with regards of EGFP-epifluorescence and confocal laser scanning microscopy. Infection on day 10-12 after generation of EHTs with a virusparticle count/cell of 50-100 for 24-48 h was considerd as optimal. In that setting the following major results have been obtained:
The viral infection and/or the overexpression of EGFP per se resulted in a clear decrease of contractility (-33 until -48%) as compared to not-infected EHTs.
PPI-1 overexpressing EHTs (AdEGFP/PPI-1) showed an increase in sensitivity to the positive inotropic effect of isoproterenol (3,1 fold vs. not-infected controls and 1,5 fold vs. AdEGFP controls).
In the monolayer culture the following major results have been obtained:
PPI-1 overexpressing KMNR showed an increased PKA-induced phospholamban phosphoryation, a pivotal regulatory protein of calciummetabolism in cardiac myocytes, at Serin16 compared to not-infected controls (+15 and +77% respectivley) and AdEGFP (+3 and +38% respectivley) KMNR.
In PPI-1 overexpressing KMNR the cAMP increasing effect of isoproterenol was decrased compared to not-infected (-22%) and AdEGFP infected controls (-26%).
Discussion: Taken together this data show that (1) EGFP encoding adenoviral vectors per se impair contractility of of cardiac myocytes and (2) overexpression of PPI-1 results in an increased catecholamine-sensitivity where an increased phosphorylation of phospholamban is included. The decrease of cAMP concentration after PPI-1 overexpression is indicating a compensatory mechanism before PKA activation in the adrenergic siganlling.
So the data give a strong arguement for he hypothesis that PPI-1 constitutes a positive feedback element in the beta-adrenergic signalling cascade of the heart.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende