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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38899
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3889/


Untersuchungen zur Bioaktivierung eines in vitro Embryotoxizitätstests mit embryonalen Stammzellen der Maus (Mus musculus L.)

Investigating biotransformation systems for an in vitro embryotoxicity test with embryonic stem cells of the mouse (Mus musculus L.)

Binder, Markus

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SWD-Schlagwörter: Biotransformation , Embryotoxizität , in vitro , Zellkultur , Teratogen , Herzmuskelzelle , Valproinsäure , Cyclophosphamid , Albendazol , Maus , Ratt
Freie Schlagwörter (Deutsch): Embryonaler Stammzelltest , EST , Proteratogen , ES-D3 , 3T3 , Valpromid , Retinol, Retinsäure , Hepatozyten , Kokultur , H4IIE, HepG2, EROD, UGT, GST
Freie Schlagwörter (Englisch): embryotoxicity , cell culture , pro-teratogen , cardiomyocytes , valproic acid , retinol , cyclophosphamide , hepatocytes , mouse , rat , co-culture
Basisklassifikation: 42.42 , 42.17 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Renwrantz, Lothar (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 27.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Mit dem wissenschaftlich validierten Embryonalen Stammzelltest (EST) können embryotoxische Testsubstanzen, sogenannte Teratogene, in vitro nachgewiesen werden. In vivo ist es jedoch möglich, dass auch zunächst nicht teratogene Verbindungen, sogenannte Proteratogene, aufgrund der Stoffwechselaktivität des Organismus zu Teratogenen metabolisiert werden. Diese Proteratogene können im EST nicht nachgewiesen werden, weil dem EST ein metabolisch aktives System fehlt. Ziel dieser Arbeit war es daher, zu untersuchen, unter welchen Bedingungen der EST auch Proteratogene identifizieren kann, und wie er dazu modifiziert werden muss.
Der EST basiert auf der Fähigkeit embryonaler Stammzellen der Maus (ES-D3-Zellen), sich innerhalb von zehn Tagen in schlagende Herzmuskelzellen zu differenzieren, was als Modell für die Embryonalentwicklung verwendet werden kann. Ein EST besteht dabei insgesamt aus drei verschiedenen in vitro-Tests. In einem Differenzierungsassay bilden sich aus ES-D3-Zellen Zellaggregate (Embryoid Bodies, EBs), die im Verlauf des Assays kontrahierende Areale ausbilden. Diese können am Tag 10 mikroskopisch detektiert werden. Als Maßzahl für die embryotoxische Wirkung der Testsubstanz wird die (Halbhemm-) Konzentration ermittelt, bei der die Hälfte der EBs durch die Substanz an der Differenzierung in Kardiomyozyten gehindert werden (ID50-Wert). In zwei weiteren Zytotoxizitätstests mit embryonalen ES-D3-Zellen bzw. differenzierten, adulten Fibroblasten (3T3-Zellen) werden die Halbhemmkonzentrationen des Zellwachstums bestimmt (IC50D3-Wert bzw. IC503T3-Wert), um allgemein toxische Effekte von spezifisch differenzierungshemmenden Effekten abgrenzen zu können. Mit diesen drei Halbhemmkonzentrationen kann mit Hilfe eines biostatistischen Prädiktionsmodells das embryotoxische Potenzial der Testsubstanz bestimmt werden.
Die Zielsetzung dieser Arbeit wurde in mehreren Schritten bearbeitet. Dabei wurden die Proteratogen-Teratogenpaare Valpromid / Valproinsäure (VPD/VPA), Retinol / all-trans-Retinsäure (RO/RA), Cyclophosphamid / 4-Hydroperoxycyclophosphamid (CPP/4HC) und Albendazol / Albendazol-Sulfoxid (ABZ/ASO) als Modellsubstanzen eingesetzt. 1) Es wurde untersucht, ob der EST Proteratogene von ihren teratogenen Metaboliten unterscheiden kann; ob der gefundene Unterschied die Datenlage in vivo widerspiegelt; und welche der untersuchten Proteratogene sich als Modellsubstanz für ein neues Testsystem eignen. 2) In einem neu zu entwickelnden EST mit metabolisch aktivem System (mEST) sollten zur Bioaktivierung Leberzellen zusammen mit den Zellen des EST kultiviert werden (statische Kokultur mit Hilfe von Zellkultureinsätzen). Primäre Hepatozyten von Maus und Ratte, sowie die Zelllinien H4IIE, Hepa1-6, HepaRG und HepG2 wurden schrittweise auf folgende Parameter untersucht: Toleranz der Versuchsbedingungen; Aktivität von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus (EROD, PROD, BROD, UGT1/2, GST-Assay); und Umsatz der Modellsubstanzen. Anschließend wurde geprüft, ob 3) der mEST die Proteratogene identifizieren kann, und 4) wie effizient mit dem mEST gearbeitet werden kann.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der EST Proteratogene von Teratogenen unterscheiden kann, was mit dem Vergleich der Halbhemmkonzentrationen unter zusätzlicher Berücksichtigung spezifisch berechneter Zytotoxizitäts- bzw. Zytotoxizität-Differenzierungs-Quotienten gelingt. Weiterhin wurde ein mEST aufgebaut, in dem die Zellen des EST mit H4IIE- bzw. HepG2-Zellen als Bioaktivierungssystem erfolgreich kokultiviert werden konnten. Zum Nachweis der Proteratogene Valpromid, Retinol und Cyclophosphamid war dieser mEST jedoch nicht geeignet, weil die Hepatomazellen die Proteratogene nicht genügend umsetzten, die teratogenen Metaboliten nicht schnell genug zu den Zielzellen diffundieren konnten, oder die Modellsubstanzen sich als zu reaktiv oder zu flüchtig erwiesen. Zur Kokultur im mEST sollten alternative Zellen mit höherer Stoffwechselaktivität eingesetzt werden. Die statische Kokultur als Möglichkeit, ein Bioaktivierungssystem an den EST zu koppeln, eignet sich zur Untersuchung von Proteratogenen, deren Metabolite über mehrere Tage stabil bleiben.
Kurzfassung auf Englisch: With the Embryonic Stem Cell Test (EST), embryotoxic substances can be detected in vitro. These substances are also termed teratogens. In vivo it is possible, that substances which are not teratogenic by itself are metabolised to such teratogens. These so-called pro-teratogens cannot be detected by the EST, because the EST has no metabolic capacity. It was therefore the aim of this study to investigate, under which conditions the EST can detect pro-teratogens, and how the test has to be modified to achieve this capability.
The EST uses the ability of murine embryonic stem cells (ES-D3 cell line) to differentiate into contracting cardiomyocytes within ten days of culture - a process which can serve as a model for embryonic development in vivo. The EST consists of three different in vitro tests. In a differentiation assay with ES-D3 cells, embryoid bodies (EBs) are formed which develop contracting areas that can be assessed on day 10 by microscopic inspection. As a parameter for embryotoxicity, the halfmaximal concentration of the test substance is determined, where 50% of the EBs are inhibited in their differentiation into contracting cardiomyocytes (ID50). In another two cytotoxicity tests with embryonic ES-D3 cells and differentiated (adult) 3T3 cells, the 50%-inhibition of cell proliferation is determined (IC50D3 and IC503T3). The cytotoxicity tests serve to separate the inhibition of differentiation from general toxic effects. With the three toxicity values, the embryotoxic potential of the test substance can be classified by using a biostatistical prediction model that was developed for the EST.
The present work was conducted in several steps and the following pro-teratogen / teratogen-pairs tested: Valpromide / valproic acid (VPD/VPA), retinol / all-trans-retinoic acid (RO/RA), cyclophosphamide / 4-hydroperoxycyclophosphamide (CPP/4HC) and albendazole / albendazole-sulfoxide (ABZ/ASO). 1) It was investigated whether the EST can differentiate between pro-teratogens and their teratogenic metabolites; whether the results reflect the situation in vivo; and which pro-teratogens are suited as model substances to be tested in an EST with metabolic capacity (mEST). 2) To bioactivate the EST, metabolically competent liver cells were tested to be cultivated together with the cells of the EST (static co-culture in cell culture inserts). Primary hepatocytes from mouse and rat, as well as the liver cell lines H4IIE, Hepa1-6, HepaRG and HepG2 were selected and stepwise tested for the following parameters: tolerance of test conditions; enzyme activity (EROD, PROD, BROD, UGT1/2, GST-Assay); and metabolism of model substances. It was then investigated 3) whether the new mEST can detect pro-teratogens, and 4) how efficient the mEST performs.
In the present work, it could be shown that the EST can distinguish between pro-teratogens and teratogens. This is possible through a comparison of the halfmaximal concentrations and parallel consideration of the specifically calculated Cytotoxicity- and Cytotoxicity-Differentiation-Ratios. Furthermore, a new mEST was developed in which H4IIE and HepG2 cells as a bioactivation system could be successfully co-cultivated with cells of the EST. This mEST was however not suited to detect the pro-teratogenic properties of valpromide, retinol and cyclophosphamide, because the hepatoma cells did not metabolise these substances in a sufficient amount, the metabolite could not diffuse fast enough to the target cells, or the model substances were too reactive or volatile. As a bioactive component for the mEST, alternative cells with higher metabolic activity should be used. The static co-culture as a method to integrate a bioactivation system into the EST is suited for model substances whose metabolites remain stable for several days.

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