FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38919
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3891/


Enzymkinetik der humanen RNase Dicer in Zellextrakten und Charakterisierung eines Sulforhodamin B bindenden RNA-Aptamers mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

Enzyme kinetic of the human RNase Dicer in cell extracts and characterisation of a sulforhodamine B binding RNA aptamer by fluorescence-correlation spectroscopy

Werner, Arne

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (6.991 KB) 


Freie Schlagwörter (Deutsch): Sulforhodamin B , Patent Blau V , Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie , Roentgenkleinwinkelstreuung , Dicer , RNAi , RNA-Aptamere
Basisklassifikation: 42.12
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.09.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 25.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Das RNase III-Enzym Dicer ist beteiligt an der posttranskriptionellen und translationalen
Regulation der Genexpression. Das Enzym weist in gereinigter Form eine sehr geringe
Aktivität auf. In der vorliegenden Arbeit wurde humaner Dicer deshalb in Gegenwart
zytosolischer Komponenten, in zytosolischen Zellextrakten, enzymkinetisch charakterisiert.
Ein auf Diffusion basierter Enzym-Assay wurde mittels Fluoreszenz-Korrelations-
Spektroskopie (FCS) entwickelt. Der Enzym-Substrat-Komplex (ES-Komplex) konnte von Substrat
und Produkt durch seine signifikant höhere Diffusionszeit unterschieden werden.
Die Substratabhängigkeit der Dicer-Aktivität in zytosolischen HEK293-Zellextrakten ergab
eine halbmaximale Enzymaktivität bei einer Substratkonzentration von 76 nM. Mit Hilfe der ES-Komplex-Konzentration wurde
für überproduzierten humanen Dicer eine katalytische Konstante von 42 s-1 und eine
Spezifitätskonstante von 5,5 x 108 M-1 s-1 im diffusionslimitierten Bereich bestimmt. Es wurde
mit einem Hill-Koeffizienten von 1,8 eine positive Kooperativität festgestellt, die einen
Hinweis auf die Regulation der Aktivität gibt.
Die Anwendung von state-of-the-art konfokaler Mikroskopie
und neu entwickelten photostabileren Fluorophoren, das Fixieren von Diffusionszeiten in der Fitting-Routine und die Verwendung von Grenzwerten in der Datenanalyse erlaubten eine Unterscheidung zwischen Diffusionsspezies über Konzentrationsunterschiede von vier Größenordnungen.
In einem zweiten Projekt wurde das Sulforhodamin B bindende RNA-Aptamer mittels FCS
analysiert. Es wurde demonstriert, dass in FCS-Messungen von Aptamer-
Fluorophor-Komplexen simultan photophysikalische Eigenschaften des Fluorophors und
Mobilität sowie molekulare Größe der RNA erfasst werden können. Sulforhodamin B wies im
SRB2m-Komplex eine 4-fach erhöhte Diffusionszeit auf. Das Fluorophor Patent Blau V
(PBV) ergab keine Autokorrelationsfunktion. Die erheblich erhöhte molekulare Zählrate im
Komplex mit SRB2m ermöglichte FCS-Messungen. Der hydrodynamische Radius rH von SRB2m betrug im Komplex
mit PBV 1,9 nm und mit Sulforhodamin B 2,9 nm. Die
Hypothese einer durch PBV verursachten Reduktion der molekularen Größe der RNA, die
verbunden ist mit einer Auftrennung in Monomere, wurde in Experimenten mit
Roentgenkleinwinkelstreuung bestätigt.
Kurzfassung auf Englisch: The RNase III-enzyme Dicer is involved in the posttranscriptional and translational regulation
of gene expression.The human RNase Dicer shows, when purified, very low activity.
Therefore, in this work, human Dicer was enzymatically characterized in cytosolic cell
extracts in the presence of cytosolic cofactors. An enzyme assay based on changes of
diffusion time was developed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
The enzyme substrate (ES)-complex did show a significantly higher diffusion time than
product and substrate, and could therefore be distinguished from the two diffusion species.
The dependence of enzyme activity on substrate concentration of human Dicer
was further investigated in cytosolic HEK293-cell extracts. The enzyme attained the half
maximum enzyme activity at a substrate concentration of 76 nM. The pico- to femtomolar
ES-complex concentration increased after Dicer overexpression and showed a similar
dependence on substrate concentration as did enzyme activity. ES-complex concentration
remained relatively constant during linear product formation. The analysis of the ES-complex
with respect to enzyme kinetic theory reveals the accuracy of the experimental data.
Using ES-complex concentrations, a catalytic constant of 42 s-1 and a specificity
constant of 5.5 x 108 M-1 s-1 close to the diffusion limited range were found for overproduced
human Dicer. A positive cooperativity with a hill coefficient of 1.8 was deduced, giving a first
look into the mode of regulation of enzyme activity. Endogenous Dicer gave kinetic constants
of similar range.
Applying state-of-the-art confocal microscopy and newly developed more photostable fluorophores, setting known diffusion times as fixed values in the fitting procedure and applying thresholds in data analysis allowed a discrimination between diffusion species over concentration
differences of four orders of magnitude.
In a second project, the sulforhodamine B binding RNA aptamer SRB2m was analyzed by
FCS. In this work it was demonstrated, that photophysical properties of the fluorophore as
well as mobility and molecular size of the RNA in fluorophor-aptamer-complexes could be
simultaneously measured by FCS. The sulforhodamine B-SRB2m complex showed a 4-fold
increased diffusion time compared to unbound sulforhodamine B. A second fluorophore,
patent blue V (PBV), gave no autocorrelation function. The 36-fold increased molecular
brightness of the complex of PBV and SRB2m enabled FCS measurements with excellent
signal-to-noise-ratio. The hydrodynamic radius rH of the PBV- and Sulforhodamin B-SRB2m
complex was 1.9 nm and 2.9 nm, respectively. The
hypothesis that a reduction of the molecular size of SRB2m by PBV due to a separation into
monomers occurred, was verified by small angle X-ray scattering experiments.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende