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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38955
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3895/


Metabolismus von Rotkleeisoflavonen

Metabolism of red clover isoflavones

Maul, Ronald

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SWD-Schlagwörter: Metabolismus , Massenspektrometrie , Isoflavone , Bioverfügbarkeit , Nahrungsergänzungsmittel , Rotklee , Cytochrom P-450
Freie Schlagwörter (Deutsch): Irilon , Methylendioxyphenyl
Basisklassifikation: 58.34
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kulling, Sabine E. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 24.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Metabolismus von Isoflavonen (IF) aus Rotklee sowie deren Vorkommen in Nahrungsergänzungsmitteln (NEM) eingehend untersucht. Im besonderen Fokus stand die Biotransformation des IF Irilon (IRI), dessen Metabolismus zuvor in der Literatur noch keine Daten vorlagen.
Bei der Untersuchung von acht frei verkäuflichen NEM auf Rotkleebasis wurde ein Anteil an IRI zwischen 5% und 10% des Gesamtisoflavongehaltes festgestellt. Damit stellt IRI in diesen Produkten das am drittstärksten vertretene Isoflavon (IF) nach Formononetin (FORM) und BiochaninA (BioA) dar. Diese beiden Haupt IF des Rotklees zeigen in ihrem Verhältnis zueinander starke Schwankungen, repräsentieren aber zusammen über 70% der enthaltenen IF. Dabei liegen in den Rotklee NEM, anders als in den Präparaten auf Sojabasis, über drei Viertel der IF nicht als Zuckerkonjugate, sondern in Form der Aglycone vor.
In vitro Untersuchungen zum reduktiven Metabolismus durch die humane Mikrobiota zeigten, dass IRI sehr stabil gegenüber enzymatischer Umsetzung durch diese Mikroorganismen ist. So wurde nach Umsetzung mit acht Fäzesproben unterschiedlicher Spender keine nennenswerte Bildung eines Metaboliten, wie sie z.B. für Daidzein (DAI) gefunden.
Bei den in vitro Untersuchungen zum Phase I Metabolismus von IRI waren in allen Fällen ausgeprägte Substanzverluste zu beobachten, die sehr wahrscheinlich auf die Bildung von Metabolit Intermediat (MI) Komplexen mit den metabolisierenden Cytochrom P450 Enzymen (CYP) zurückzuführen sind. MI Komplexe mit CYPs sind für andere Substanzen mit MDP Strukturelement bekannt. Als Phase I Metabolite von IRI wurden vor allem die in Position C 3´ und C 8 monohydroxylierten Derivate sowie 6 Hydroxygenistein, das durch Öffnen der MDP Struktur resultiert, identifiziert. Insbesondere letztgenannter Metabolit ist aufgrund seiner Pyrogallolstruktur als ein besonders reaktives Catechol zu betrachten, welches durch „Redox-Cycling“ zu oxidativen Zellschäden führen könnte. Coinkubationen von IRI und FORM mit CYP 1A1 zeigen, dass eine deutliche Beeinflussung des Fremdstoffmetabolismus von FORM durch IRI stattfindet. So wurde die Umsetzung von FORM durch äquimolare Zugabe von IRI um 80% reduziert.
Mikrosomale Untersuchungen des Phase II Metabolismus zeigten, dass IRI in hohem Maße durch humane rekombinante Uridin-diphosphoglucuronyl-transferasen (UGT) sowie durch Human-, Schweine- und Rattenlebermikrosomen zu ein bzw. zwei Glucuroniden umgesetzt wird. Dabei handelt es sich um die in Position C 4´und C 5 verknüpften β O Glucuronide, die enzymabhängig mit unterschiedlichen Kinetiken (substratinhibiert oder autoaktiviert) gebildet werden. Für alle Säugerleber MIKs resultiert eine ähnliche intrinsische Clearance (Clint) zwischen 51 und 69 mL*mg-1*min-1. IRI wird dabei insbesondere durch die UGT Isoformen 1A1, 1A8, 1A9 und 1A10 umgesetzt. Hierbei wurde eine sehr hohe Aktivität auch für extrahepatische Isoformen wie 1A10 (Clint: 77 mL*mg-1*min-1) und 1A8 (Clint: 19 mL*mg-1*min-1) gezeigt. Somit ist von einer raschen Konjugation des aufgenommenen IRI auszugehen.
Die Bioverfügbarkeit von IRI wurde in einer Pilotstudie mit sieben Probanden untersucht. Hierbei wurden neben den Demethylierungs-produkten DAI und GEN der Hauptrotklee IF ein, bezogen auf die aufgenommene Menge überproportional hoher Anteil an IRI im Blutplasma aller ProbandInnen detektiert. Der IRI Gehalt des Plasmas nach Aufnahme der empfohlenen Tagesdosis eines handelsüblichen NEM lag bei über 0,3 µM, entsprechend einer Konzentration, die von den Haupt IF DAI und Geinistein nach Aufnahme eines Soja NEM erreicht wird.
Da IRI in einer initialen Rezeptorbindungsstudie an ERα nur eine sehr schwache Affinität zeigte, ist eine Bezeichnung von IRI als Phytoestrogen als fragwürdig anzusehen.
Insgesamt zeigen die durchgeführten Untersuchungen, dass Rotkleepräparate nur sehr eingeschränkt mit den besser untersuchten Soja-NEM vergleichbar sind. Zwar bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass nach oraler Aufnahme in beiden Fällen dominierend DAI und GEN im Plasma vorliegen, allerdings wurde bislang IRI als „Minor IF“ unterschätzt. Die biologischen Eigenschaften der Rotklee IF unterscheiden sich, wie die Untersuchungen vor allem des Phase I Metabolismus von IRI zeigen, deutlich von anderen IF.
Folglich ist auch von einer anderen physiologischen Wirkung der Rotklee NEM im Vergleich zu den Sojapräparaten auszugehen. Eine Einstufung als NEM ist kritisch zu sehen, da toxikologische Untersuchungen bis heute weitgehend fehlen und Rotklee auch nicht als gewöhnliches Lebensmittel verzehrt wird.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the present work was to thoroughly investigate the metabolism of isoflavones (IF) from red clover as well as their appearance in dietary supplements. A special focus is set on the biotransformation of the IF irilone (IRI) that has not been regarded prior to this work.
The quantitative analysis of eight commercial “over the counter” dietary supplements revealed an IRI partition of five to ten percent of the total IF fraction. Thus, IRI represents the component being present as the third-most intense IF behind formononetin (FORM) and biochaninA (BioA). The two main IF in red clover show strong deviations in their ratio, however, summed up representing more than 70% of the total IF content. In contrast to the more widespread soy based dietary supplements, in the red clover based preparations the IF are predominantly found in their aglycone form (75% of the total IF content), while in the soy products the biggest part of the IF is present as sugar conjugates.
In vitro investigations of the intestinal reductive metabolism of the IF with human faecal microbiota showed no considerable conversion of IRI to any metabolites as it can be observed for other IF. Being largely resistant to an enzymatic biotransformation by these microorganisms, no formation of potentially bioactivated products as it has been shown for daidzein can be expected for IRI.
The in vitro investigation of the phase I metabolism of IRI in all cases led to a more or less intense loss of the substrate. It is assumed that this loss is caused by the formation of a metabolite-intermediate (MI) complex. This phenomenon has already been demonstrated earlier for the cytochrome P450 (CYP) catalyzed conversion of substances with a methylenedioxy phenyl structure element as it is present in IRI. The metabolites of IRI that are formed could be identified as those in the position C 3´ and C 8 monohydroxylated derivatives of the parent compound as well as the 6 hydroxy genistein. The latter results from the elimination of the aliphatic carbon in the MDP structure element of IRI. 6 hydroxy genistein represents a particularly active catechol due to its pyrogallolic moiety, which might lead to oxidative cell damage via redox cycling. Co-incubation experiments of FORM with CYP 1A1 in presence of an equimolar IRI dosage led to a reduction of the FORM conversion by 80%. This gives a clear indication for an inhibitory influence of IRI on the metabolism of other xenobiotics.
The microsomal investigation of the phase II metabolism revealed that IRI is effectively converted to one or two monoglucuronides by human recombinant uridine-diphosphoglucuronyltransferases (UGT) and mammalian liver enzymes. The metabolites formed in vitro are the β O glucuronides conjugated in position C 4´ or C 5. The pattern and intensity of the observed formation varies depending on the enzymes used and shows atypical kinetic profiles (substrate inhibition or auto-activation) in many cases. For all mammal liver microsomes an intrinsic clearance as high as 51 to 69 mL*mg-1*min-1 was observed. With respect to the human recombinant UGT extrahepatic enzymes (UGT 1A8 and 1A10), particularly high intrinsic clearances were observed (77 mL*mg-1*min-1 and 19 mL*mg-1*min-1 respectively). Thus, a rapid conjugation of IRI after resorption in the intestinal tissue can be assumed.
The bioavailability of IRI into the body could be proven by an in vivo study comprising eight volunteers ingesting two capsules of a commercial dietary supplement. In the blood plasma of all subjects the demethylation products of FORM and BioA (daidzein and genistein) can be found as dominating IF. However, IRI is detected to a similar amount, thus showing a relatively higher plasma concentration when compared to the amount that has been initially taken up by the dietary supplement. The measured plasma level reaches up to 0.3 µM after ingestion of two capsules. This corresponds to the concentrations reported for GEN and DAI after the uptake of a comparable soy NEM.
Initial receptor binding studies with the estrogen receptor ERα showed only a weak affinity of IRI to the receptor. Hence, there are doubts whether IRI can be called a phytoestrogen.
All the obtained results clearly indicate that red clover based dietary supplements can hardly be compared to those based on soy. Although after oral uptake of red clover IF DAI and GEN are the dominating IF appearing in plasma, especially since IRI has been underestimated so far. Furthermore, the biological activities of red clover IF and their metabolic behaviour are significantly different from the characteristics known from DAI and GEN as for example the data obtained for the phase I metabolism show. Therefore, different physiological effects after ingestion of red clover based dietary supplements have to be assumed. Especially due to the fact that red clover is not part of the common human nutrition, potential toxicologically relevant effects are still unknown. Thus, a drug like assessment of the red clover dietary supplements seems essential in order to exclude possible side or adverse effects.

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