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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38967
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3896/


Untersuchung von Hypochlorit-modifizierten Proteinen und deren Rolle bei der Inhibition von HIV

van Yperen, Melanie

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Melanie van Yperen
Basisklassifikation: 42.32 , 35.76
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schmitz, Herbert (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.07.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 18.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig HOCl-modifiziertes HSA, BSA und
MSA (mHSA, mBSA und mMSA) im technischen Maßstab mithilfe des
Hohlfasersystems hergestellt. Mit diesem System kann bei einer potentiell
therapeutischen Anwendung der Inhibitor in noch größeren Mengen produziert werden.
Die relativen IC50-Werte der so hergestellten HOCl-modifizierten Serumalbumine
wurden mithilfe eines HIVNL4-3wt-Infektionstest und dem Programm GraphPad Prism
(Fa. GraphPad Software) bestimmt (mHSA 1:1000 > 5 μg/ml, mBSA 1:1000 > 3 μg/ml
und mMSA 1:1000 > 20 μg/ml). Dass die antivirale Aktivität dieser Proteine nicht
durch einen zelltoxischen Effekt verursacht wird, wurde durch einen Zellvitalitätstest
gezeigt. Die Vitalität von HeLaP4-Zellen blieb bis zu einer Konzentration von
400 μg/ml mHSA und mBSA 1:1000 bzw. > 200 μg/ml mMSA 1:1000 erhalten.
Zusätzlich wurde eine alternative Lagerung des Inhibitors etabliert, bei welcher
die Proteine getrocknet wurden.
Für Surface Plasmon Resonance-(SPR)-Bindungsstudien, die zeigten, dass der
Inhibitor an das HIV-Oberflächenprotein gp120 bindet, wurde mHSA 1:1000 erstmalig
biotinyliert. Der biotinylierte Inhibitor wurde im Gegensatz zur vorherigen Methode
direkt auf einem Biosensor immobilisiert, wodurch es zu einer einer stabileren Messung
und zu einem verbesserten Wert der Bindungskonstante (KD >10-9 M) kam.
Zusätzlich wurde mit den Daten dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die
antivirale Aktivität des Inhibitors mit einer Veränderung der Aminosäurereste
einhergeht. Es wurden kolorimetrische Tests durchgeführt, durch die eine HOClinduzierte
Abnahme des Aminogruppen (NH2)- und Thiolgruppengehalts (-SH), sowie
eine Zunahme des Carbonylgruppengehalts (-CO) in Proteinen gemessen wurde. Eine
Abnahme des NH2-Gehalts führt zu einer Abnahme der positiven Gesamtladung. Durch
die HOCl-Oxidation von -CO und -SH wiederum können negativ geladene Carboxylund
Sulfonylgruppen entstehen.
Eine Aminosäurenanalyse in Zusammenarbeit mit dem Forschungszentrum
Borstel von mHSA, mBSA und mMSA 1:1 bis 1:1000 zeigte außerdem, dass der Anteil
der Aminosäuren in der Reihenfolge Cys > Tyr > His > Met > Phe > Arg durch HOCl
modifiziert wird. Durch die Modifizierung von Poly(Glu,Lys,Tyr) wurde weiterhin die
Rolle des Tyrosins bei der Bildung des antiviralen Effekts deutlich, da der Tyrosinrest
im Poly(Glu,Lys,Tyr) der einzige reaktive Aminosäurerest ist.

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