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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-38997
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3899/


Bedeutung der Myosin-Leichtketten-Kinase für den alpha1-adrenergen positiv inotropen Effekt im Herzmuskel

MLCK (Myosin Light Chain Kinase): Downstream effector of alpha1-adrenergic signaling in the heart?

Mahnecke, Nina

Originalveröffentlichung: (2008) Grimm M, Mahnecke N et al. (2006) The MLCK-mediated alpha1-adrenergic inotropic effect ... Br J Pharmacol 148:991-1000. Grimm M et al. (2005) Key role of myosin light chain (MLC) ...Cardiovasc Res 65:211-20.
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SWD-Schlagwörter: Herzmuskel , Pharmakologie , RNS-Interferenz , Alpha-1-Rezeptor , Muskelkontraktion
Freie Schlagwörter (Deutsch): Myosin-Leichtketten-Kinase , shRNA , Lentivirus , Adenovirus , Engineered Heart Tissue
Freie Schlagwörter (Englisch): heart muscle , Myosin Light Chain Kinase , alpha1-Adrenoceptor , shRNA , Engineered Heart Tissue
Basisklassifikation: 44.85 , 42.15 , 44.40 , 42.13 , 44.38 , 42.17
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 21.11.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Hintergrund und Ziele:
Katecholamine vermitteln ihre Wirkungen am Herzen über die Aktivierung von sowohl aplha1- als auch beta-Adrenozeptoren. Durch Stimulation der Gq-gekoppelten aplha1-Adrenozeptoren wird neben der längerfristigen hypertrophen Wirkung akut ein positiv inotroper Effekt ausgelöst. Der genaue Mechanismus der aplha1-adrenergen Signalkaskade ist seit ~30 Jahren umstritten. Es gibt pharmakologische Hinweise auf eine Schlüsselrolle des Proteins Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK), wie erstmalig Daten von menschlichem Herzgewebe zeigten (Grimm et al., 2005). Diese sind zwar spannend und richtungsweisend, dennoch nicht beweisend, daher sollte in dieser Arbeit die MLCK und ihre Bedeutung für den aplha1-adrenergen positiv inotropen Effekt auf molekularer Ebene untersucht werden.

Die vorliegende Arbeit hatte folgende Ziele:
1. Die Charakterisierung des Signalweges, der die aplha1-adrenergen Signale zur Aktivierung der MLCK vermittelt.

2. Die Identifizierung der MLCK-Isoform, die für den aplha1-adrenergen positiv inotropen Effekt notwendig ist.

3. Die Untersuchung eines funktionellen MLCK Knockdowns mithilfe der RNA-Interferenz und dessen Auswirkung auf den aplha1-adrenergen Effekt.

Methoden:
1. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurde als Modell die funktionelle Messung an isolierten linken Vorhöfen der Maus unter isometrischen Bedingungen im Organbad herangezogen. Diese Methode ermöglicht eine stabile, gut reproduzierbare Messung von kontraktilen Parametern über mehrere Stunden. Um die aplha1-adrenerge Signalkaskade im Hinblick auf die MLCK zu charakterisieren, wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven des aplha1-Adrenozeptor-Agonisten Phenylephrin in Anwesenheit des beta-Adrenozeptor-Antagonisten Nadolol sowie in An- und Abwesenheit von verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren erstellt. Zusätzlich wurde mittels Inhibitor die IP3-Rezeptor-vermittelte Calciumfreisetzung und deren Auswirkung auf den alpha1-adrenergen positiv inotropen Effekt ermittelt.

2. Die MLCK-Isoformen wurden anhand von biochemischen Methoden auf Protein- und mRNA-Ebene mithilfe von Western Blot, nicht-quantitativer Reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und quantitativer RT-PCR untersucht.

3. Für die Untersuchung des Einflusses von einem Langzeit-smMLCK-Knockdown und dessen Auswirkung auf die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten wurde das Modell des Engineered Heart Tissue (EHT) gewählt, da es eine längere Behandlungszeit ermöglicht und Kontraktionsparameter relativ einfach zu erheben sind. Weiterhin wurde die Form des lentiviralen Gentransfers angewandt, da sich zeigte, dass es zu keinen unspezifischen toxischen Effekten, wie etwa mit Adenoviren, kommt.

Ergebnisse:
1. Der aplha1-adrenerge positiv inotrope Effekt nach MLCK-Inhibition durch verschiedene pharmakologische Substanzen war deutlich reduziert. Teilweise war auch die beta-adrenerg-vermittelte Kontraktionskraftzunahme durch eine MLCK-Hemmung beeinflusst. Eine Hemmung des IP3-Rezeptors hatte keinen Einfluss auf den aplha1-adrenergen positiv inotropen Effekt.

2. Die smMLCK 130 kDa hat den größten Anteil an der Gesamt-MLCK-mRNA-Menge im linken Vorhof der Maus (76,7%), gefolgt von der smMLCK 220 kDa (18,8%) und der skMLCK (4,5%). Diese Daten und zwei verschiedene Knockout-Mausmodelle (Ohlmann et al., 2005; Zhi et al., 2005) führten zu der Vermutung, dass die smMLCK 130 kDa die wichtigste Rolle bei der aplha1-adrenerg-vermittelten Kontraktions-kraftentwicklung spielt.

3. Ein smMLCK Knockdown führte in EHTs zu einer massiven Verschlechterung der Kontraktionskraft und einem verminderten Ansprechen auf den aplha1-adrenergen-Agonisten Phenylephrin. Auch die von Isoprenalin vermittelte beta-adrenerge Kontraktionskraftzunahme war durch den smMLCK Knockdown beeinflusst. Darüber hinaus war neben der Herunterregulation der smMLCK auch eine massive Reduktion des Zielproteins, der MLC2, mittels Western Blot festzustellen. Andere kardiale Strukturproteine blieben von dem smMLCK Knockdown unbeeinflusst.

Schlussfolgerung:
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die smMLCK 130 kDa die dominante MLCK-Isoform im Herzen ist, wobei die cMLCK noch unbetrachtet geblieben ist. Die ausgeprägte Reduktion des Phenylephrineffektes in smMLCK Knockdown-EHTs ist ein molekularer Beleg für die Bedeutung dieses Proteins in der aplha1-adrenergen Signalkaskade. Die drastische Abnahme der basalen Kraft spricht aber für eine konstitutive Rolle der smMLCK für den basalen Kontraktionsmechanismus und könnte durch den Verlust von MLC2 erklärt werden, dieser Zusammenhang muss zukünftig untersucht werden.
Kurzfassung auf Englisch: Background:
The effect of catecholamines is mediated by activation of aplha1- as well as by beta-adrenoceptors. Stimulation of Gq-coupled aplha1-adrenoceptors causes a long-term hypertrophy outcome and an acute positive inotropic effect. The exact mechanisms of the aplha1-adrenergic positive inotropic effect have been enigmatic and controversial for more than 30 years. Pharmacological evidence suggested involvement of myosin light chain kinase (MLCK), as for the first time shown in human heart muscle by Grimm et al. (2005). These results are fascinating and trend-setting but not evidentiary. Therefore, this thesis focuses on MLCK and their role in the aplha1-adrenergic positive inotropic effect at molecular level.

The present thesis had following aims:
1. Characterisation of the signalling pathway, which imparts the aplha1-adrenergic signals for MLCK activation.

2. Identification of the MLCK-isoform, which is essential for the aplha1-adrenergic positive inotropic effect.

3. Investigation of a functional MLCK knockdown by RNA interference and its consequence on the aplha1-adrenergic positive inotropic effect.

Methods:
1. To study this question the model of functional force measurement on isolated left mice atria under isometric conditions in organ baths was used. This method allows a stable and reproducible measurement of contractile parameters for several hours. In presence of the beta-adrenoceptor-antagonist nadolol the aplha1-adrenoceptor-agonist phenylephrine was used in a dose-response-relationship with or without different pharmacological inhibitors to distinguish the aplha1-adrenergic signalling cascade with regard to MLCK. In addition, the IP3-receptor-mediated calcium release and its implication on the aplha1-adrenergic positive inotropic effect was determined.

2. The MLCK-isoforms were analyzed by biochemical methods on protein- and mRNA-level through western blots, non-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and quantitative RT-PCR.

3. The model of “Engineered Heart Tissue” (EHT) was chosen for the investigation of the influence of a long-term-smMLCK-knockdown and its consequence on the contractile function of cardiac myocytes. This model offers a long treatment period and the contractile parameters are easy to measure. Moreover, a lentiviral-based gene transfer was used, since it shows no unspecific toxic effects as the adenoviruses.

Results:
1. After MLCK-inhibition with different pharmacological matters the aplha1-adrenergic positive inotropic effect was reduced distinctly. The beta-adrenergic-mediated increase in force was partly affected, as well. The IP3-receptor-inhibiton had no influence on the aplha1-adrenergic positive inotropic effect. This leads to the assumption that the calcium for the calcium/calmodulin-dependent MLCK derives from another, so far unknown, source.

2. The smMLCK 130 kDa shares the biggest part of the total-MLCK-mRNA-amount in the mouse left atrium (76.7%), followed by smMLCK 220 kDa (18.8%) and the skMLCK (4.5%). The basis of these data in combination with two different knockout-mouse-models (Ohlmann et al., 2005; Zhi et al., 2005) induced the presumption that the smMLCK 130 kDa plays the major role in the aplha1-adrenergic-mediated development of contractile force.

3. In EHTs the smMLCK knockdown caused a massive impairment of the force of contraction and a diminished reaction to the aplha1-adrenoceptor-agonist phenylephrine. Also the beta-adrenergic-mediated increase in force by isoprenaline was affected by the smMLCK knockdown. Beyond downregulation of smMLCK an enormous reduction of the target-protein, the MLC2, was detectable by western blot. Other cardiac structure proteins were unaffected by the smMLCK knockdown.

Conclusion:
The smMLCK 130 kDa is the dominant MLCK-isoform in the heart; however, the cMLCK was not investigated. The distinct reduction of the phenylephrine effect in smMLCK knockdown-EHTs is a molecular evidence for the importance of this protein in the aplha1-adrenergic signalling cascade. The dramatic decrease of the basal force indicates a constitutive role of the smMLCK for the basal contractile mechanism. The loss of MLC2 could be an explanation for these results, and this context should be explored in the future.

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