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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39205
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3920/


Motor neuron differentiation in the developing and the regenerating adult spinal cord of zebrafish Danio rerio (HAMILTON, 1822)

Motorneurondifferenzierung in Entwicklung und adulter Regeneration des Rückenmarks von Danio rerio (HAMILTON, 1822)

Reimer, Michell Mario

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Regeneration , Adult , Zebrafisch , Rückenmark , Motorneuronen
Freie Schlagwörter (Englisch): regeneraiton , adult , zebrafish , spinal cord , motorneuron
Basisklassifikation: 42.23
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Renwrantz, Lothar (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 16.12.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Im Gegensatz zu Säugetieren besitzt der Zebrafisch die Fähigkeit zur funktionellen Rückenmarksregeneration. Dabei sind Motorneurone ein wichtiger postsynaptischer Zelltyp für Axone die vom Hirnstamm her regenerieren. Das Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob Motorneurone im lädierten Rückenmark regenerieren und die Differenzierungssignale für Motorneurone während der adulten Regeneration und der Embryonalentwicklung zu erforschen. Es konnte gezeigt werden, dass grosse, differenzierte Motorneurone nach einer kompletten Rückenmarksdurchtrennung vorübergehend verloren gehen und nach erfolgter Regeneration wieder nachweisbar sind. Um dies zu zeigen, wurden transgene Tiere mit Reportergenen für die Motorneuronmarker HB9 bzw. islet-1 und immunhistochemische Marker zur Darstellung von Motorneuronen verwendet. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass Motorneurone durch verletzungsbedingten Zelltod verloren gehen und dann im Zuge der Regeneration ersetzt werden. Tatsächlich kann eine transiente, massive Zunahme kleiner, undifferenzierter Motorneurone beobachtet werden. Mit Hilfe des Proliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU) konnte nachgewiesen werden, dass diese undifferenzierten Motorneurone neu gebildet wurden. Eine signifikante verletzungsbedingete Prolifertation wurde nur am Ventrikel festgestellt. Ferner zeigte sich durch „lineage tracing“, dass eine olig2 exprimierende Subpopulation der ventrikulären Ependymo-Radialgliazellen die vermutlichen Stammzellen oder Progenitorzellen für Motorneurone im Rückenmark darstellen.
Eine Rückenmarksdurchtrennung im adulten Zebrafisch führt zu einer Erhöhung der Expression von sonic hedgehog (shh), einem Differenzierungssignal für Motorneurone während der Embryonalentwicklung. Intraperitoneale Injektion des shh -Antagonisten Cyclopamin während der Regeneration blockiert diesen Signalweg und führt zu einer signifikanten Reduktion der Proliferation von Progenitorzellen sowie der Motorneurondifferenzierung. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass shh eine zentrale Rolle für die Regeneration von Motorneuronen im adulten Zebrafisch einnimmt.
Um die axonalen Differenzierung von Motorneuronen genauer zu erforschen, wurde die Funktion des Zellerkennungsmoleküls plexinA3 bei dem Auswachsen embryonaler primärer Motoraxone untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass plexinA3 spezifisch von primären Motorneuronen exprimiert wird. Eine experimentelle Verringerung der Expression dieses Proteins mittels Injektion von anti-sense Morpholino-Oligonukleotiden bewirkt ein ektopisches Auswachsen aus dem Rückenmark sowie exzessives Verzweigen der Axone primärer Motorneurone. In einem “Rescue-Experiment” konnte durch Überexpression von plexinA3 der Morpholino-Effekt neutralisiert werden. Dies belegt die Spezifität der genetischen Manipulation und zeigt das plexinA3 äußerst wichtig für die axonale Wegfindung während der Entwicklung ist.
Abschließend kann festgestellt werden, dass der adulte Zebrafisch unter Kontrolle von shh zur Regeneration von Motorneuronen fähig ist. Als Quelle für diese neu entstehenden Motorneurone dienen endogene Progenitor- oder Stammzellen. Bei der axonalen Wegfindung von primären Motorneuronen während der Embryogenese spielt plexinA3 eine Schlüsselrolle. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse über Motorneuronendifferenzierung im Zebrafisch, können schlussendlich helfen, neue Strategien für die Regeneration von Motorneuronen nach Rückenmarksverletzungen oder Behandlungen für Erkrankungen der Motorneuronen, wie beispielsweise der amyotrophen Lateralsklerose, zu entwickeln.
Kurzfassung auf Englisch: Zebrafish, in contrast to mammals, are capable of functional spinal cord regeneration. Spinal motor neurons are major targets for axons regenerating from the brainstem. Using immunohistochemical markers and transgenic reporter fish for motor neuron markers (HB9, islet-1), this study demonstrates that large differentiated motor neurons are transiently lost after a spinal lesion, suggesting that these cells undergo cell death after a lesion and may be replaced by proliferation. Indeed, a massive and transient increase in the number of small, undifferentiated motor neurons, which were labelled by the proliferation marker bromodeoxyuridine, was observed. Proliferation and lineage tracing studies indicated significant proliferation only at the spinal ventricle and that a subset of olig2 expressing ependymo-radial glial cells are the likely motor neuron progenitor/stem cells in the lesioned spinal cord.
A spinal lesion increased expression of sonic hedgehog (shh), an embryonic differentiation signal for motor neurons. Blocking this signal with an antagonist reduced progenitor cell proliferation and motor neuron differentiation. This suggests that shh is an important signal for motor neuron differentiation during adult motor neuron regeneration.
To learn more about axonal differentiation of motor neurons, the role of the cell recognition molecule plexinA3 was investigated during the outgrowth of embryonic primary motor axons. The molecule is selectively expressed in primary motor neurons. Knockdown of expression led to ectopic exiting from the spinal cord and excessive branching of motor axons. Over-expression of full length plexinA3 rescued this effect, indicating specificity of experimental manipulations. Thus, plexinA3 expression is crucial for motor axon pathfinding during development.
Overall, this study demonstrates that adult zebrafish are capable of motor neuron regeneration from endogenous progenitor/stem cells and that shh is an important regulator of motor neuron regeneration. PlexinA3 is crucial for motor axon differentiation in embryonic zebrafish. This study establishes adult spinal cord lesion as a model system for motor neuron regeneration, which may ultimately help to find ways to promote motor neuron regeneration also in human conditions, such as spinal cord injury or motor neuron disease.

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