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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39356
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3935/


NCAM induces caspase-3 activation to reorganize the membrane cytoskeleton to enhance neurite elongation in mice (Mus musculus L., 1758)

NCAM induziert die Aktivierung der Caspase-3 zur Reorganisation des Membranzytoskeletts und Förderung des Neuritenwachstums in Mäusen (Mus musculus L., 1758)

Westphal, Doreen

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SWD-Schlagwörter: Caspasen , Spectrin , Neurales Zell-Adhäsionsmolekül , Zellskelett , Wachstumskonus , Apoptosis
Freie Schlagwörter (Deutsch): Neuritenwachstum , Lipid Raft , nicht-apoptotisch , CHO-Zellen , Wachstumskegel , Zytoskelett
Freie Schlagwörter (Englisch): neurite outgrowth , non-apoptotic , growth cone , cytoskeleton , caspases
Basisklassifikation: 42.23 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 22.12.2008
Kurzfassung auf Englisch: The neural cell adhesion molecule (NCAM) promotes neurite outgrowth in vitro. This process relies on the remodeling of the cytoskeleton in growth cones. Previously, it has been shown that NCAM is associated with the spectrin-actin meshwork, but it has remained unclear how NCAM induces cytoskeletal rearrangements to mediate neurite outgrowth. Our data indicate that NCAM activates cysteine proteases called caspases that proteolytically disassemble the spectrin meshwork at the growth cone. Immunocytochemical analysis revealed that caspases-3 and -8 were present in growth cones of cultured hippocampal neurons. Moreover, NCAM formed a complex with active caspase-8, a known activator of caspase-3, in brains of young 1- to 3-days old mice. Antibody induced clustering of NCAM at the plasma membrane of NCAM140 expressing CHO cells led to the rapid activation of the initiator caspase-8 but not of caspase-9. Clustering of NCAM at the cell surface of 1 day-old live neurons in vitro resulted in an increased level of active caspase-3 in neurons. These data indicate that NCAM induces caspase-8 and caspase-3 activation. Levels of proteolytic beta1-spectrin, beta2-spectrin and alpha2-spectrin fragments in growth cones isolated from NCAM deficient brains were decreased, suggesting that spectrin meshwork remodeling is reduced in the absence of NCAM. Interestingly, clustering of NCAM in isolated growth cones enhanced proteolytic cleavage of alpha2-spectrin. This enhancement was completely abolished in the presence of caspase-3 and caspase-8 inhibitors. Since NCAM clustering at the cell surface results in its redistribution into lipid rafts we analyzed levels of caspases in these membrane microdomains. Levels of caspases-3 and -8 but not of caspase-9 were reduced in lipid rafts isolated from NCAM deficient brains. NCAM, therefore, might be involved in the recruitment of these caspases into lipid rafts. Finally, in a functional assay we also analyzed the effects of caspase inhibitors on neurite elongation of hippocampal neurons stimulated with soluble NCAM-Fc. We observed that inhibitors of caspases-3 and -8 but not of caspases-9 and -10 abolished the NCAM mediated increase in neurite outgrowth rate. Thus, our data suggest an important role for caspases-3 and -8 in the NCAM mediated reorganization of the cytoskeleton. We hypothesize that locally restricted activation of caspases initiated by NCAM occurs in lipid rafts.
Kurzfassung auf Deutsch: Das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM fördert in vitro das Neuritenwachstum. Dieser Wachstumsprozess basiert auf einer kontinuierlichen Umgestaltung des Zytoskeletts in den Wachstumskegeln der Neuriten. In vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass NCAM intrazellulär mit dem stabilisierenden Spektrin-Aktin-Netzwerk assoziiert ist. Allerdings ist bislang ungeklärt, wie NCAM Strukturveränderungen des Zytoskeletts induziert, um das Neuritenwachstum zu fördern. Unsere Daten lassen darauf schließen, dass NCAM Caspasen aktiviert, die das Spektrin-Netzwerk des Wachstumskegels proteolytisch abbauen. Mittels immunzytochemischer Analysen wurden Caspase-3 und Caspase-8 in den Wachstumskegeln kultivierter hippokampaler Neurone nachgewiesen. Außerdem bildete NCAM in Gehirnen von jungen Mäusen einen Komplex mit aktiver Caspase-8. Clustering von NCAM-Molekülen an der Zelloberfläche von NCAM140-exprimierenden CHO-Zellen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern führte zu einer schnellen Aktivierung der Initiator-Caspase-8, aber nicht der Caspase-9. NCAM-Clustering an der neuronalen Plasmamembran führte außerdem zu einem erhöhten Level an aktiver Caspase-3 in den Nervenzellen. Dies lässt darauf schließen, dass NCAM die Aktivierung der Caspasen-3 und -8 induziert. In Wachstumskegeln, die aus NCAM-defizienten Gehirnen isoliert wurden, war interessanterweise der Anteil proteolytisch gespaltener alpha2-, beta1- und beta2-Spektrinfragmente reduziert. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Umbildung des Spektrin-Zytoskeletts in Abwesenheit von NCAM verringert ist. In diesem Zusammenhang ist es interessant zu erwähnen, dass NCAM-Clustering in isolierten Wachstumskegeln zu einer erhöhten Proteolyse von alpha2-Spektrin führte. Diese gesteigerte Proteolyse wurde allerdings vollständig durch die Zugabe von Inhibitoren der Caspase-3 und der Caspase-8 blockiert. Clustering von NCAM auf der Zelloberfläche durch spezifische Antikörper führt dazu, dass NCAM seine zelluläre Lokalisation verändert und vermehrt in Mikrodomänen der Plasmamembran, sogenannten Lipid rafts, zu finden ist. Wir untersuchten daher die Lokalisation von Caspasen in Lipid rafts. Im Rahmen dieser Untersuchungen stellte sich heraus, dass Lipid rafts von Gehirnen, in denen kein NCAM exprimiert wird, deutlich weniger Caspase-3 und Caspase-8 enthielten als Lipid rafts des Wildtyps. NCAM könnte somit an der Rekrutierung beider Caspasen in die Mikrodomänen beteiligt sein. Wir untersuchten schließlich die Effekte der Caspaseinhibitoren auf das Neuritenwachstum hippokampaler Neurone, die mit löslichem NCAM-Fc stimuliert wurden. NCAM-Stimulation mit Hilfe dieser Fusionsproteine förderte das Wachstum hippokampaler Neuriten. Die Inhibitoren der Caspasen-3 und -8, nicht jedoch der Caspasen-9 und -10, blockierten diese NCAM-induzierte Förderung des Neuritenwachstums. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Caspasen-3 und -8 eine wichtige Funktion in der NCAM-induzierten Umgestaltung des Zytoskeletts besitzen. Wir vermuten zudem, dass die von NCAM hervorgerufene, lokal begrenzte Aktivierung der Caspasen in Lipid rafts stattfindet.

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