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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39410
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3941/


Die Beurteilung potentieller photoinduzierter Schäden anhand quantitativer Bestimmungen von reaktiven Sauerstoffspezies und die Entwicklung eines ESR-spektroskopischen Nachweises von Sauerstoffradikalen in humanem Kapillarblut

The evaluation of potential photoinduced damage by quantifying reactive oxygen species and the development of an EPR-spectroscopic assay for the detection of oxygen free radicals in human capillary blood

Klack, Anke

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SWD-Schlagwörter: Oxidativer Stress , Ultraviolett , Kapillarblut , Reaktive Sauerstoffspezies , Elektronenspinresonanzspektroskopie , Vitamin C
Freie Schlagwörter (Deutsch): Ascorbylradikal , FORM-Test
Basisklassifikation: 35.71
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Duchstein, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 22.12.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung einer Methode zur Beurteilung der schadhaften Auswirkung von UV-A-Strahlung auf den menschlichen Körper durch die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies im Kapillarblut. Es wurde zunächst ein kommerziell erhältliches Testsystem auf photometrischer Basis auf seine Arbeitsweise und dessen Anwendbarkeit im Rahmen kosmetischer Studien untersucht. Das besagte System basiert auf der acetat-gepufferten Reaktion organischer Hydroperoxide mit einem N,N-dialkylierten p-Phenylendiamin in der Gegenwart katalytischer Mengen von Übergangsmetallionen.
Die Reaktion führt zur oxidativen Bildung eines intensiv gefärbten Radikalkations dessen Bildungsgeschwindigkeit von der Konzentration der anwesenden Hydroperoxide in der Probe abhängig ist. Die Menge organischer Hydroperoxide in biologischen Proben gilt als Indikator für die Inzidenz schädigender Prozesse durch oxidativen Stress speziell der Lipidperoxidation. Die Untersuchung der Zusammensetzung, der Arbeitsweise des Systems hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und der Linearität sowie die Überprüfung des farbgebenden Prinzips mittels ESR-Spektroskopie führten zu dem Einsatz des Systems in einer kosmetischen Probandenstudie mit 127 freiwilligen Testpersonen.
Zur Beurteilung des wechselseitigen Einflusses zwischen Haut und systemischem Kompartiment wurden den Probanden pflanzliche Extrakte mit belegter antioxidativer Wirksamkeit verabreicht, für die ein photoprotektives Potential diskutiert wird. Der Einfluss der in Kapselform applizierten Extrakte aus Camellia sinensis und Vitis vinifera wurde gegenüber einem Placebo über insgesamt acht Wochen durch zwei Messungen (t_1 nach vier Wochen und t_2 nach acht Wochen) beobachtet. Als Surrogatparameter für die Lage des prooxidativ-antioxidativen Gleichgewichtes und somit für den Belastungszustand durch oxidative Prozesse wurde die UV-A-induzierte ultraschwache Photonenemission (UPE) der Probanden auf dem oberen Rücken im Abgleich mit der Menge an organischen Hydroperoxiden im Kapillarblut bestimmt. Es konnte weder zum Zeitpunkt t_1 noch zum Zeitpunkt t_2 ein signifikanter Einfluss der Pflanzenextrakte in den applizierten Mengen nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine geschlechterspezifische Abhängigkeit der photometrisch bestimmten Hydroperoxidkonzentration.
Die bestimmten Werte fielen besonders hoch aus für Frauen, die weibliche Geschlechtshormone applizierten. In einem Langzeit-Experiment über insgesamt zwölf Monate konnte ein Zusammenhang mit der Applikation oraler Kontrazeptiva nachgewiesen werden. Es stellte sich heraus, dass das Testsystem nicht spezifisch für Hydroperoxide arbeitet. Als mit dem hormonellen System assoziierter Blutbestandteil mit einem signifikanten Einfluss auf den gemessenen Wert konnte das Plasmaprotein Caeruloplasmin identifiziert werden.
Anhand der festgestellten Mängel des untersuchten Systems wurde eine Neuerwägung der Anforderungen an ein Testsystem mit dem in der Zielsetzung formulierten Einsatzbereich angestellt. Diese führte zu der neuen Zielsetzung eine Bestimmung mit dem genannten Aussagewert unter der Quantifizierung einer Markersubstanz für oxidativen Stress auf der Basis eines ESR-Assays zu entwickeln.
Die ESR-Spektroskopie ermöglicht die direkte Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies mit Radikalcharakter ohne eine vorausgehende Indikatorreaktion. Als weiteres Kriterium für die Entwicklung der neuen Bestimmungsmethode wurde die Quantifizierung der Markersubstanz in Relation zu ihrem Edukt angelegt. Unter der Annahme eines Quasi-Steady-State-Modells für die Beschreibung des prooxidativ-antioxidativen Gleichgewichtes sollte so eine verbesserte Aussage zu der Verschiebung der Gleichgewichtslage auf die Seite der prooxidativen Prozesse ermöglicht werden. Die Voraussetzungen für die Entwicklung waren die Anwendbarkeit des Systems auf Probanden im Zuge kosmetischer Studien, sowie die Durchführung beider quantifizierender Messungen (Markersubstanz und deren Edukt) aus derselben Probe. Es wurde ein System zum spezifischen Nachweis der radikalischen Semidehydroascorbinsäure im Verhältnis zu ihrem Edukt Ascorbinsäure (Ascorbat) etabliert. Die Besonderheit des Systems liegt in der Verwendung von maximal 75 muL Plasma als Probenmatrix, aus welcher beide Bestimmungen nacheinander durchgeführt werden können. Für die schmerzarme Gewinnung eines entsprechenden Aliquotes an kapillarem Vollblut wurde ein spezielles Probenzugsystem entwickelt. Das Signal der radikalischen Semidehydroascorbinsäure wurde als charakteristisches Dublett im ESR-Spektrum nachgewiesen und die im Probenvolumen enthaltene Ascorbinsäure durch eine oxygraphisch verfolgte Reaktion mit dem Enzym Ascorbatoxidase quantifiziert.
In einer Studie mit 16 Testpersonen zeigten sich die entwickelten Methoden als für Probanden im Rahmen kosmetischer Studien anwendbar. Zur Beurteilung der Aussagekraft des Systems im Sinne der Zielsetzung erhielten die Probanden zu zwei Messterminen im Abstand einer Woche eine Bestrahlung von 20 J UV-A am Unterarm wobei zu einem der Messtermine vor der Bestrahlung eine Formulierung mit UV-A-Filter topisch appliziert wurde. Anhand der einzelnen Messgrössen Semidehydroascorbinsäure (n= 13, p=0,1) und deren Edukt Ascorbinsäure (n= 7, p 0,1) konnte mit den etablierten Methoden kein Einfluss der UV-protektiven Formulierung nachgewiesen werden. Durch die Betrachtung des Radikals im Verhältnis zu seinem Edukt konnte dieser Nachweis ( die Verminderung der Bildung des Radikals) erbracht werden (n=5, p=0,1)
Kurzfassung auf Englisch: he main purpose of this work was the development and establishment of a method capable to assess the damaging effects of UV-A-irradiation to the human system by quantifying reactive oxygen species in capillary blood. A commercialized colorimetric test system was used in a cosmetic trial after the examination of the suitability of the test principle. The assay is based on the oxidative conversion of a N,N-disubstituted-p-phenylenediamine derivative at an acidic pH by organic hydroperoxides in the presence of transition metals. The formation of a deeply coloured radical-cation is a function of the amount of hydroperoxides in the sample which are commonly used as a marker for the incidence of oxidative stress. 127 volunteers participated in the trial, that included the administration of capsules containing herbal extracts with well known antioxidant potential to serve as an indicator for the influence on the systemic prooxidant-antioxidant balance.
The influence of standardized extracts from Camellia sinensis and Vitis vinifera were observed and compared with a placebo group over eight weeks. UV-A- induced ultraweak photon emission (UPE) of the skin in the upper back area was used as a surrogate for skin oxidative stress status. Significant influence could neither be assessed after a period of four weeks nor after eight weeks of extract-administration.
The examined hydroperoxide levels showed a significant gender dependance and were found to be especially high in women who were administering female sexual hormons. The photometric test system was shown not to be working specific for hydroperoxides but to be affected by ceruloplasmine levels thus not being a suitable analytical device for the assessment of UV-induced reactive oxygen species formation.
Regarding the examined disadvantages a new approach towards the quantification of reactive oxygen species including EPR-spectroscopy in regard to the main aim was made. Another criterion for the new test system was to be able to quantify an oxidative-stress marker-substance in relation to the educt that it is rising from. The quai-steady-state-assumption was used for an improved statement about the prooxidant-antioxidant balance shift towards prooxidative processes should be made. Preconditions for the development of the assay further than the application of EPR-spectroscopic methods were the applicability of the methods to cosmetic trials as well as the quantification on both analytes (marker-substance and educt) from the same sample volume.
A system for the specific determination of ascorbyl free radical put into perspective towards ascorbate base levels was designed. The innovative aspect about the new system was the use of not more than 75 muL plasma sample volume obtained from capillary blood for both ascorbyl free radical and ascorbate quantification.
A customized sampling device for the rather pain-free collection of blood aliquotes from the fingertip was developed. The characteristic dublett signal of the ascorbyl free radical was measured by X-band EPR and ascorbate base levels were quantified by oxygraphic tracing of the specific oxidation of ascorbate by ascorbate oxidase. A pilot study with 16 volunteers proved the applicability of the developed methods within cosmetic trial study-designs. For the assessment of the test-systems force of expression in regard to the main aim volunteers obtained a 20 J UV-A-irradiation of the forearm before and after a one week washout-phase. The first irradiation treatment was performed without the use of sunscreen whereas during the second irradiation UV-A-protection was used. Values for ascorbyl free radical and ascorbate were obtained before and after irradiation. Single regard of both parameters ascorbyl free radical (n=13, p= 0,1) and its educt ascorbate (n=7, p= 0,1) did not reveal any protective influence of the sunscreen formulation on reactive oxygen species formation. However by regarding the quotient of the ascorbyl free radical and ascorbate base levels a significantly lower extend of ascorbyl free radical production under the use of UV-A-protection was observed (n=5, p= 0,1).

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