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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39559
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2008/3955/


Untersuchung zur Exzision und zielgerichteten Integration in Weizen (Triticum aestivum L.) und Zitterpappelhybriden (Populus tremula L. x P. tremuloides) mit dem FLP/FRT-Rekombinationssystem

Excision and targeted Integration of Transgenes in Wheat (Triticum aestivum L.) and Poplar Hybrids (Populus tremula L. x P. tremuloides) via the FLP/FRT-Recombination System

Schenk, Tobias

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SWD-Schlagwörter: Exzision <Genetik> , Transgene Pflanzen , Weizen <Gattung> , Espe , Integration <Genetik>
Freie Schlagwörter (Deutsch): FLP/FRT, sequenz-spezifische Rekombination
Freie Schlagwörter (Englisch): FLP/FRT, site-specific recombination
Basisklassifikation: 48.58 , 42.43
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Lörz, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 29.12.2008
Kurzfassung auf Deutsch: Bei der Herstellung von transgenen Pflanzen im Rahmen der Resistenzforschung aber auch für andere Fragestellungen werden Markergene zur Selektion eingesetzt. Da diese jedoch nach ihrer Selektion keine Funktion mehr ausüben erscheint es nicht nur im Hinblick auf die biologische Sicherheit transgener Pflanzen sinnvoll, diese nach ihrer Verwendung wieder zu entfernen. Darüber hinaus schränkt die EU-Richtlinie 2001/18/EG die Freisetzung von transgenen Pflanzen die Antibiotikaresistenzmarker enthalten ein, bzw. verbietet deren kommerzielle Zulassung bei Verwendung von Resistenzgenen humanmedizinisch relevanter Antibiotika. Neben der Exzision solcher Markergene ist auch die zielgerichtete Integration von Transgenen ein großes Ziel aktueller Forschungen. Da der Insertionsort eine entscheidende Rolle für die Transgenstabilität und -expression ausübt, ist es gerade für langlebige Bäume wie der Zitterpappel wichtig, Transgene an Positionen im Genom zu integrieren, die sich in Voruntersuchungen als geeignet erwiesen haben. Da sich durch eine zielgerichtete Integration außerdem mögliche Mutationen durch die Insertion des Transgens in kodierende Genombereiche oder unerwünschte Positionseffekte vermeiden lassen, wäre die Etablierung einer solchen Methode von großem Wert.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich eine Methode zur Eliminierung von Markergenen sowie zur zielgerichteten Integration von Transgenen mit Hilfe des FLP/FRT-Rekombinationssystems aus Hefe in Weizen (Triticum aestivum L.) und Zitterpappelhybriden (Populus tremula L. x P. tremuloides) etabliert werden.
Dazu wurden zunächst verschiedene induzierbare Promotoren mittels PCR aus Reis und Weizen isoliert und mit dem GUS-Gen kombiniert. In transienten Expressionsstudien wurden diese Promotor-Konstrukte auf ihre Induzierbarkeit in Weizenembryonen untersucht. Der bereits in Vorversuchen in Zitterpappel eingesetzte hitzeinduzierbare Promotor Gmhsp17.5-E zeigte hierbei auch in Weizen eine hohe und ausschließliche hitzeinduzierbare Expression. Daher wurde er in den weiteren Klonierungsschritten zur Expression der FLP-Rekombinase in den Exzisions- und Integrationskonstrukten verwendet.
Durch biolistische Transformation von 5950 Weizenembryonen konnten 16 unabhängige Weizenlinien mit dem Exzisionskonstrukt (pTex) hergestellt werden. Mit der Agrobakterien-vermittelten Transformationsmethode von Zitterpappelblattstücken konnten aus insgesamt 1193 Blattstücken sogar 27 transgene Linien mit dem Exzisionskonstrukt erhalten werden.
Nach Aktivierung des Rekombinationssystems in den transgenen Pflanzen konnte die dadurch ausgelöste Exzision der DNA erfolgreich durch histochemische GUS-Färbung in 31% der Weizenlinien und in 61% der Zitterpappellinien identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die Exzision des verwendeten Kanamycin-Markergens (nptII) durch PCR- und Sequenzanalysen der DNA in beiden Pflanzen und zusätzlich auch durch Southern Blot Analysen verifiziert werden.
Für die nachfolgenden Integrationsstudien mit dem promotorlosen bar-Gen konnten insgesamt 12 unabhängige doppeltransgene Zitterpappellinien hergestellt werden. Das eine Konstrukt (TSin1) trägt die für die Rekombination nötige FLPase, auf dem anderen Konstrukt (TSin2) liegt von zwei FRT-sites flankiert das zum Nachweis der Integration verwendete promotorlose bar-Gen. Nach der Hitzeaktivierung von acht doppeltransgenen Zitterpappellinien konnten in bis zu 7,4% der Fälle putative Integrationsereignisse durch Selektion auf Basta®-haltigem Medium identifiziert werden. Anschließende PCR- und Sequenzanalysen mit genomischer DNA ergaben eine Integrationsrate des promotorlosen bar-Gens in den durch FRT-sites definierten Genomlocus von 6,4% bezogen auf die Gesamtanzahl der hitzebehandelten Pflanzenstücke. Und damit konnte erstmals in Bäumen eine zielgerichtete Integration eines Transgens (bar-Gen) mit einer so hohen Effizienz gezeigt werden.

Das in dieser Arbeit eingesetzte FLP/FRT-Rekombinationssystem stellt ein gutes Verfahren zur erfolgreichen Exzision eines Markers mit anschließender zielgerichteter Integration eines Fremdgens für die Herstellung transgener Pflanzen dar.

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