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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39140
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/3914/


Identifikation, Genexpressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung von Peptidasen von Entamoeba histolytica (Schaudinn, 1903)

Tillack, Manuela

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SWD-Schlagwörter: Entamoeba , Peptidasen , Microarray , Pathogenität
Basisklassifikation: 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Tannich, Egbert (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 12.01.2009
Kurzfassung auf Deutsch: Die Amöbiasis wird durch die Infektion mit dem humanpathogenen Protozoon E. histolytica hervorgerufen und ist neben Malaria und Schistosomiasis eine der häufigsten Parasitosen in tropischen und subtropischen Gebieten. Während der Infektion besiedelt der Parasit über einen längeren Zeitraum asymptomatisch den Darm. In Einzelfällen kommt es zu einem invasiven Verlauf mit klinischen Manifestationen (Amöbenkolitis, Amöbenleberabszess (ALA)). Bislang konnten nur wenige Moleküle beschrieben werden, die mit der Invasion des Erregers assoziiert sind. Im Besonderen wurden einem Adhärenzlektin, porenbildenden Peptiden (Amoebapores) sowie einigen Peptidasen eine Funktion bei der Pathogenese zugeschrieben.
Im ersten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung ausgewählter Cysteinpeptidasen (CPs) an pathologischen Prozessen untersucht. Dabei wurde erstmalig die unter Kulturbedingungen stark synthetisierte Peptidase EhCP-A1 berücksichtigt. Für EhCP-A1 konnte weder eine Beteiligung an der Zytopathogenität in vitro noch an der ALA-Bildung im Mausmodell nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde für EhCP-A5 gezeigt, dass diese Peptidase neben seinen bereits bekannten pathogenen Eigenschaften zusätzlich das Fehlen weiterer Pathogenitätsfaktoren kompensieren kann. In amoebapore a-defizienten Amöben, die in vivo keine ALAs induzierten, führte die Überexpression von EhCP-A5 zur Bildung von Abszessen, die erneut die Größe von Wildtyp-induzierten ALAs erreichten. Die Überexpression des unter Kulturbedingungen schwach exprimierten Gens ehcp-a4 war ebenfalls erfolgreich, allerdings wurde keine Beteiligung des entsprechenden Proteins an in vitro-Invasionsprozessen nachgewiesen.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde aufgrund von Datenbankanalysen gezeigt, dass im Genom von E. histolytica insgesamt 86 Peptidasegene vorliegen, weit mehr als bislang angenommen wurde. Diese Daten dienten als Grundlage für die Erstellung eines Mikroarrays zur umfassenden Untersuchung der Transkription von Peptidasegenen. Es wird vermutet, dass sowohl bei der Pathogenität von E. histolytica als auch bei dem Überleben des Parasiten im menschlichen Wirt neben Peptidasen Amoebapores und enzymatische Antioxidantien eine wichtige Rolle spielen. Aus diesem Grund wurde eine Auswahl entsprechender Gene in die Mikroarraystudien integriert. In einem ersten Schritt wurde das Expressionsprofil des Referenzisolates HM-1:IMSS unter Standardkulturbedingungen ermittelt. Die bekannte starke Expression von ehcp-a1, -a2 und -a5 konnte bestätigt werden. Eine moderate Expression wurde für 17 weitere Peptidasegene gemessen, die Mehrheit der untersuchten Gene wurden schwach exprimiert. Auch die Mehrheit der Antioxidantien- und amoebapore-Gene war moderat oder schwach exprimiert. Lediglich 11 der insgesamt 70 Gene, darunter Gene für amoebapore a, peroxiredoxin und superoxid-dismutase wiesen eine starke Expression auf.
Somit sind lediglich 10 % der untersuchten Gene im Trophozoitenstadium stark exprimiert. Für die unter Kulturbedingungen moderat oder schwach exprimierten Gene ist vorstellbar, dass die entsprechenden Proteine eine Funktion während En- bzw. Excystierungsprozessen oder der Wirtsbesiedlung übernehmen.
Bei dem Vergleich von Expressionsprofilen pathogener und apathogener Kulturisolate wurden nur geringe Expressionsunterschiede einzelner Gene gemessen. Kokultivierungen von Trophozoiten mit verschiedenen Zellen (Bakterien, Erythrozyten etc.) veränderten das Standardexpressionsprofil nicht. Hingegen zeigten Trophozoiten, die einem oxidativen Stress (Modell für den Kontakt mit aktivierten Makrophagen) bzw. einem Hitzestress (Modell für die Temperaturerhöhung während der Leberinvasion) ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Kontrollen eine stärkere Expression von verschiedenen Antioxidantiengenen und von zwei normalerweise schwach exprimierten Peptidasegenen (ehcp-a4 und -a6).

Im dritten Teil der Arbeit sollten mittels ELISA-Studien Hinweise auf die Peptidasesynthese während der Infektion im Menschen gewonnen werden. Zu diesem Zweck wurden die Antikörperreaktionen gegen 10 EhCPs, die größtenteils unter Kulturbedingungen nicht oder schwach exprimiert sind, in Seren von ALA-Patienten, asymptomatischen E. histolytica-Trägern und E. dispar-Trägern in ELISA-Studien miteinander verglichen. In den Seren der meisten ALA-Patienten konnten spezifische Antikörper gegen die ausgewählten Peptidasen nachgewiesen werden. Da Kreuzreaktionen mit den stark synthetisierten CPs ausgeschlossen werden könnten, deutet dies darauf hin, dass sich das Expressionsprofil während der Leberabszessbildung verändert.
Somit scheinen unter Kulturbedingungen normalerweise schwach exprimierte cp-Gene unter anderen Lebensbedingungen, wie z.B. bei der Wirtsinvasion, Hitze- und oxidativem Stress, stärker exprimiert zu werden.


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