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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-39816
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2009/3981/


Functional Investigation of the ATPase/Helicase Domain of Human Dicer

Funktionelle Untersuchung der ATPase/Helikase-Domäne von humanem Dicer

Obi, Ikenna R.

pdf-Format:
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Freie Schlagwörter (Deutsch): humanes Dicer
Freie Schlagwörter (Englisch): human Dicer
Basisklassifikation: 42.13 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.01.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 11.02.2009
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was the recombinantly production, and characterisation of the
ATPase/Helicase (A/Hel) domain of human Dicer (hDicer). The production of the A/Hel
domain of hDicer as a His-tag-fusion protein in E. coli resulted in the formation of insoluble
protein aggregates (inclusion bodies). However, the N-terminal fusion of maltose-binding
protein (MBP) from E. coli to the A/Hel domain resulted in the production of a soluble A/Hel
protein, which was purified to homogeneity using amylose and Ni-NTA affinity
chromatographies. The A/Hel domain was also produced in High Five insect cells but the
resultant protein could not be purified to homogeneity.
The A/Hel protein exhibited an ATPase activity independent of the presence of RNA
but dependent on Mg2+ ions. The ATPase reaction followed Michaelis-Menten kinetics with a
corresponding Km ATP constant of 207.5 DM and a turnover number, kcat ATP, of 10 min-1. The
recombinant protein showed nucleotide specificity, hydrolyzing only purine and not
pyrimidine triphosphates. Additionally, the protein did bind single-stranded RNA (ssRNA),
but did not bind small interfering RNA (siRNA). Furthermore, gel-shift and Florescence
Resonance Energy Transfer (FRET)-based assays used to investigate unwinding activity
showed that the A/Hel protein was unable to unwind dsRNA substrates used in this study.
Moreover, using the FRET-based assay, it could be demonstrated that the protein enhanced
RNA annealing.
Future experiments should be based on the elucidation of the physiological
significance of these results. Together with the outcome of the physiological investigations,
the results of this study could provide an insight into the functions of hDicer and contribute to
our understanding of its mode of action within RNA interference.
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Produktion und Charakterisierung der
ATPase/Helicase (A/Hel)-Domäne vom humanen Dicer (hDicer). Die Produktion der A/Hel-
Domäne des hDicer als His-Tag-Fusionsprotein in E. coli ergab unlösliche Proteinaggregate
(Inclusion Bodies). Die N-terminale Fusion des Maltose-Bindungsprotein (MBP) von E. coli
mit der A/Hel- Domäne ergab die Produktion eines löslichen A/Hel-Proteins, welches mittels
Affinitätschromatographie über Amylose und Ni-NTA Säulen aufgereinigt werden konnte.
Zusätzlich wurde die A/Hel-Domäne in High-Five-Insekten-Zellen produziert. Das
resultierende Protein konnte jedoch nicht mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt
werden.
Das A/Hel-Protein besaß eine ATPase-Aktivität, die unabhängig von der Anwesenheit von
RNA, jedoch abhängig von Mg2+ Ionen war. Die ATPase-Reaktion folgte der Michaelis-
Menten-Kinetik mit einer korrespondierenden Km ATP-Konstante von 207,5 DM und einer
Wechselzahl kcat ATP von 10 min-1. Das rekombinante Protein zeigte Nukleotidspezifität, da es
nur Purin-, nicht jedoch Pyrimidin-Triphosphate hydrolysierte. Zusätzlich band das Protein an
einzelsträngige RNA (ssRNA), aber nicht an Small Interfering RNA (siRNA).
Des Weiteren wurden zur Untersuchung der Entwindungsaktivität Gel-Shift- und
Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET)-basierende Assays durchgeführt. Es zeigte
sich, dass das A/Hel-Protein nicht dazu fähig war, die als Substrat dienende dsRNA zu
entwinden. Es wurde jedoch mit Hilfe des FRET-Assays nachgewiesen, dass das Protein das
Annealing an RNA verstärkt.
Auf diesen Ergebnissen sollten zukünftige Experimente für die Aufklärung der
physiologischen Signifikanz basieren. Die Ergebnisse auf dieser Arbeit aufbauender
physiologischer Untersuchungen können die Erkentnisse dieser Arbeit ergänzen und so zum
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Verständnis über die Funktion des hDicer-Proteins und seiner Rolle im Mechanismus der
RNA-Interferenz beitragen.

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